복부암 수술과 관련된 면역 및 산화 스트레스 반응 (IMOX)

배경

수술 전후 기간은 상대적으로 짧지만 암 관련 생존에 매우 중요합니다. 외과적 절차는 종양 세포를 국부적으로 그리고 혈액에서 방출하고 외과적 스트레스 반응(SSR)을 유도합니다. 이는 면역 체계의 마비, 암세포 제거 감소, 암세포의 성장 및 전이를 위한 최적의 조건으로 이어집니다(1).

대장암(CRC)은 덴마크에서 세 번째로 흔한 암 원인입니다. 2013년에 4,196명의 덴마크 환자가 CRC(2) 진단을 받았으며 현재 치료 표준에는 종양 절제가 포함됩니다. 그러나 예상되는 근치적 외과적 종양 절제술 후에도 25-30%는 1차 수술 후 5년 이내에 재발합니다.

암 수술 후 결과를 개선하기 위해서는 SSR이 면역 반응에 어떤 영향을 미치는지, SSR이 암세포의 성장과 전이 능력에 어떤 영향을 미치는지 자세히 이해하는 것이 중요합니다. 수술 전후 전혈에서 40.000개 이상의 유전자 발현 프로파일링을 수행하여 과립구, 단핵구, B 및 T 세포, 수지상 세포 및 혈소판을 포함한 순환하는 면역 세포에서 유전자의 유전적 서명을 얻을 것입니다. 수술이 이러한 면역학적 요인의 유전자 전사에 미치는 정확한 영향을 확인하십시오. 이 정보를 사용하여 수술 전후 개입을 수행하여 수술 전후 기간에 면역학적 반응을 최적화할 수 있으므로 암 재발 위험이 감소하고 결과적으로 생존율이 향상됩니다(3).

외과적 스트레스 반응(SSR) 외과적 시술은 면역학적 및 염증성 균형의 교란을 유도하여 전신 염증 반응(4), 면역 억제(4,5) 및 과도한 활성산소종(ROS)(6)을 유발한다는 것은 잘 알려져 있습니다. ,7). 전신 염증은 종양 성장을 촉진하고(8), 결장직장암에 대해 잠재적으로 근치적 절제술을 받은 환자에서 전신 염증 반응의 존재는 불량한 결과를 예측합니다(3). 면역 체계의 마비에는 NK 세포와 대식세포의 활동 감소가 포함되며, 둘 다 정상적인 상황에서 파종하는 종양 세포를 제거하여 전이를 방지합니다. 과도한 ROS는 DNA 손상, 세포외 기질 분해 및 세포-세포 유착 제거를 유발합니다(5,6,7). 이러한 방식으로 수술은 암 세포가 수술 후 단계에서 성장하고 전이하기 위한 최적의 조건을 촉진합니다. 최근 연구에 따르면 면역 세포와 원발 종양의 침입이 환자의 예후와 관련이 있으며, 이는 다시 면역 반응이 암 성장 억제에 중요함을 시사합니다(9,10). 수술로 인한 다양한 면역 반응 요인의 유전적 변화에 대한 자세한 정보는 불분명합니다.

연구 설계 이 프로젝트는 결장암 UICC 스타디움 II-III로 인해 선택적 반-결장 절제술을 받는 30명의 환자를 포함하는 임상 전향적 탐구 연구로 구성됩니다. 혈액 샘플은 수술 전날과 수술 후 1, 2, 3, 10일에 수집됩니다. 샘플은 유세포 분석, 바이오 뱅킹, 동결 보존 및 전혈 게놈 프로파일링을 위해 준비됩니다.

전혈 유전자 발현 프로파일링을 수행하고 분석하여 수술로 인한 면역학적, 염증성 및 산화 스트레스 관련 요인을 암호화하는 유전자의 가능한 전사적 변화를 결정합니다. 이러한 유전적 변화에 대한 정량적 측정과 정성적 측정이 모두 가능합니다(11). 수술 전후에 가장 유의미하게 차등적으로 발현되는 것으로 밝혀진 프로브 세트를 추가 분석을 위해 선택합니다. 염증, 면역학적 및 산화 스트레스 분야 내에서 이전 연구에서 상당히 규제가 완화되고 설명된 유전자가 추가 분석을 위해 선택됩니다. 면역학 및 염증 내의 정확한 유전자의 예는 TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ 및 HLA-G를 암호화하는 유전자입니다. 산화 및 항산화 유전자 내에서 FoxO3, TP53 및 ATM의 불활성화는 ROS 수준의 증가와 관련되므로 특별히 강조될 것입니다. ATOX1, DEFB122 및 GBX8의 상향조절은 증가된 ROS 수준과 관련이 있으며 추가 분석을 위해 선택될 것입니다(19-21).

특정 염증 및 면역 조절 단백질(TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ 및 HLA-G)의 변경, 자연 살해(NK) 세포의 기능적 활성 및 분획 면역 세포의 특정 하위 집단의 절대 수(CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim 조절 T 세포, CD4+HLA-G+ 조절 T 세포, 골수 유래 억제 세포 및 NK 하위 집합 ) 식별됩니다. 유전자 전사 분석 결과와 염증 및 면역 조절 단백질의 변이 분석 결과를 비교하여 SSR에 대한 전체 개요를 제공하고 수술이 면역, 산화 및 염증 인자에 미치는 영향을 비교하여 잠재적인 발암성을 평가합니다. 수술의 효과, 이 손상 과정에서 최적의 개입 시간과 방법.

등록된 30명의 환자로부터 얻은 종양 샘플은 면역학적 세포의 침입 수준에 대해 분석될 것입니다. 결과는 수술 전 전혈 샘플에서 결정된 염증 및 면역 조절 단백질의 유전자 발현 프로파일링 및 분석의 결과와 상호 연관될 것입니다. 면역조직화학을 수행하고 종양의 염증 침윤을 Klintrup의 방법(12) 및 면역점수(13)에 따라 평가할 것입니다. 이러한 방법은 헤마톡실린 및 에오신 슬라이드에서 확인된 염증 세포의 가장 깊은 침입 지점을 정의하는 점수 시스템을 기반으로 합니다.

행동 양식

전혈 유전자 발현 프로파일링:

혈액 샘플은 PAX-유전자 튜브에 수집되어 분석을 위해 오덴세 대학 병원, 임상 유전학과로 보내집니다. 전체 RNA는 Paxgene Blood RNA 키트(Qiagen, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 추출하고 RNA의 품질은 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)를 사용하여 테스트합니다. Message-AmpTM III RNA 증폭 키트(Ambion, Austin, TX)는 전체 RNA를 비오틴 표지된 aRNA로 변환하는 데 사용됩니다. 표지된 aRNA는 Affymetrix HGU133 Plus 2.0 칩에 혼성화됩니다. 데이터 전처리는 모든 마이크로어레이의 백그라운드 보정, 정규화 및 발현 인덱스 계산을 수행하기 위해 강력한 다중 어레이 평균 발현 측정(rma)을 사용하여 R 환경에서 수행됩니다. 더 높은 수준의 분석에는 감독 및 비감독 방법을 포함하여 고차원 데이터에 대한 고급 방법이 포함됩니다. 배수 변화를 계산하고 마이크로어레이(SAM) 및 t-테스트의 유의성 분석을 사용하여 차별적으로 발현된 유전자, 샘플을 확인하고 FDR 방법을 사용하여 다중 가설 검정을 위한 수정을 수행합니다. Gene Set Enrichment Analysis(GSEA, Broad Institute)를 사용하여 외과적 조작에 의해 활성화된 생물학적 메커니즘을 식별하기 위해 경로 분석이 적용될 것입니다.

염증 및 면역학적 마커의 평가:

모든 샘플이 수집되면 바이오뱅크 혈장 및 혈청의 일부를 TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ 및 HLA-G의 농도 측정에 사용합니다. Roskilde Hospitals, Dept.of의 BEP2000 ELISA 장비(Siemens Healthcare, Erlangen, Germany)의 ELISA 임상 생화학, 그들은 이러한 조치에 대해 많은 경험을 가지고 있습니다.

백혈구 하위 집단의 분석:

백혈구 하위 집단의 다색 면역 표현형 검사는 혈액 샘플을 채취한 후 1-2시간 이내에 수행됩니다. 분석은 BD FACS Canto II 기기(BD Biosciences, New Jersey, USA)를 사용하여 수행됩니다. 이 기기는 튜브당 8가지 색상/마커를 분석합니다. 특정 마커 패널을 사용하여 CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim 조절 T 세포, CD4+HLA-G+ 조절 T 세포, 골수 유래 억제 세포 및 NK 서브세트를 식별할 것입니다. 결과는 수술 전날부터 수술 후 10일까지의 기간 동안 염증 및 면역학적 상향 또는 하향 조절에 따라 분석됩니다.

종양 표본의 면역조직화학적 분석:

면역조직화학은 모든 샘플이 수집되었을 때 수행될 것입니다. 침입의 깊이와 CD4, CD8, CD45RO 및 GZMB를 발현하는 세포의 수를 분석할 것입니다. 분석은 0-3 범위의 점수화 방법인 Klintrup의 방법에 따라 수행됩니다. 0점은 종양 침습 변연의 가장 깊은 지점에서 염증 세포가 증가하지 않았음을 나타냅니다. 1은 온화하고 고르지 못한 증가를 나타냅니다. 2는 현저한 염증 반응을 나타내고, 3은 암세포 섬의 빈번한 파괴와 함께 침습 가장자리에 화려한 컵 모양의 염증 침윤을 나타냅니다. 이 점수는 낮은 등급(0과 1)과 높은 등급(2와 3)으로 분류됩니다.

NK 세포 PBMC의 동결 보존 후 분리한 후, NK 세포의 기능적 활성을 크롬 표지된 NK 민감성 표적 세포에 노출시켜 시험관 내에서 측정합니다. NK 세포 활성은 NK 세포 용해된 표적으로부터 방출된 크롬의 측정에 의해 이 검정에서 정량화된다.