Respuesta al estrés inmunológico y oxidativo en relación con la cirugía del cáncer abdominal (IMOX)

Fondo

El período perioperatorio es relativamente corto, pero muy crítico para la supervivencia relacionada con el cáncer. El procedimiento quirúrgico da como resultado la liberación de células tumorales localmente y en la sangre, y la inducción de una respuesta de estrés quirúrgico (SSR). Esto conduce a la parálisis del sistema inmunitario, reducción de la eliminación de células cancerosas y condiciones óptimas para que las células cancerosas crezcan y metastaticen(1).

El cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa más común de cáncer en Dinamarca. En 2013, 4196 pacientes daneses fueron diagnosticados con CCR(2) y el estándar de atención actual incluye una resección del tumor. Sin embargo, incluso después de una resección tumoral quirúrgica curativa esperada, el 25-30% tendrá una recaída dentro de los 5 años posteriores al procedimiento primario.

Para mejorar el resultado después de la cirugía para el cáncer, es crucial comprender, en detalle, cómo SSR afecta la respuesta inmune y cómo SSR afecta la capacidad de las células cancerosas para crecer y hacer metástasis. Mediante la realización de perfiles de expresión de más de 40 000 genes en sangre total antes y después de la cirugía, obtendremos una firma genética de los genes de las células inmunitarias circulantes, incluidos granulocitos, monocitos, células B y T, células dendríticas y plaquetas, lo que nos permitirá vea el impacto exacto que tiene la cirugía en la transcripción de genes de estos factores inmunológicos. Al usar esta información, se pueden realizar intervenciones perioperatorias para optimizar la respuesta inmunológica en el período perioperatorio, lo que reduce el riesgo de recurrencia del cáncer y, en consecuencia, mejora la supervivencia (3).

Respuesta al estrés quirúrgico (SSR) Es bien sabido que un procedimiento quirúrgico induce una alteración del equilibrio inmunológico e inflamatorio, provocando una respuesta inflamatoria sistémica (4), inmunosupresión (4,5) y exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS) (6 ,7). La inflamación sistémica promueve el crecimiento tumoral (8), y en pacientes que se han sometido a una resección potencialmente curativa por cáncer colorrectal, la presencia de una respuesta inflamatoria sistémica predice un mal resultado (3). La parálisis del sistema inmunitario incluye la reducción de la actividad de las células NK y los macrófagos, los cuales, en circunstancias normales, protegen contra la metástasis al eliminar las células tumorales que se diseminan. El exceso de ROS provoca daños en el ADN, ruptura de la matriz extracelular y eliminación de las adherencias célula-célula (5,6,7). De esta manera, la cirugía promueve condiciones óptimas para que las células cancerosas crezcan y metastaticen en la fase postoperatoria. Investigaciones recientes muestran que las células inmunitarias y su invasión del tumor primario se correlacionan con el pronóstico del paciente, lo que nuevamente sugiere que la respuesta inmunitaria es importante para inhibir el crecimiento del cáncer(9,10). La información detallada de los cambios genéticos en diferentes factores de la respuesta inmune debido a la cirugía sigue sin estar clara.

Diseño del estudio El proyecto consiste en un estudio clínico prospectivo exploratorio que incluye a 30 pacientes sometidos a hemicolectomía electiva por cáncer de colon estadio II-III de la UICC. Las muestras de sangre se recogerán el día anterior a la cirugía y los días 1, 2, 3 y 10 del postoperatorio. Las muestras se prepararán para análisis de citometría de flujo, biobancos, crioconservación y perfiles genómicos de sangre entera.

Se realizará y analizará un perfil de expresión génica de sangre completa para determinar posibles cambios transcripcionales en genes que codifican factores relacionados con el estrés inmunológico, inflamatorio y oxidativo causados ​​por la cirugía. Es posible realizar una medición tanto cuantitativa como cualitativa de estos cambios genéticos (11). Los conjuntos de sondas que se encuentren expresados ​​diferencialmente de manera más significativa antes y después de la cirugía se elegirán para un análisis posterior. Los genes que estén significativamente desregulados y que hayan sido descritos en estudios previos, dentro del campo de la inflamación, el estrés inmunológico y oxidativo, serán elegidos para su posterior análisis. Ejemplos de genes exactos dentro de la inmunología y la inflamación serán los genes que codifican TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ y HLA-G. Dentro de los genes oxidativos y antioxidantes, se hará especial hincapié en FoxO3, TP53 y ATM ya que la inactivación de estos se asocia con un aumento de los niveles de ROS. La regulación al alza de ATOX1, DEFB122 y GBX8 está asociada con mayores niveles de ROS y también se elegirá para un análisis posterior (19-21).

Alteraciones en proteínas moduladoras inflamatorias e inmunes específicas (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ y HLA-G), la actividad funcional de las células asesinas naturales (NK) y las fracciones y números absolutos de subpoblaciones específicas de células inmunitarias (CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+/CD4+CD25+CD127/dim células T reguladoras, CD4+HLA-G+ células T reguladoras, células supresoras derivadas de mieloides y subconjuntos NK ) será identificado. Los resultados del análisis de transcripción genética y el análisis de alteraciones en proteínas moduladoras inflamatorias e inmunes se compararán para dar una visión completa de la SSR y el efecto de la cirugía en factores inmunológicos, oxidativos e inflamatorios, para evaluar el potencial cancerígeno. efecto de la cirugía, y tiempos y métodos de intervención óptimos en este proceso dañino.

Las muestras de tumores de los 30 pacientes inscritos se analizarán para determinar el nivel de invasión de células inmunológicas. Los resultados se correlacionarán con los resultados del perfil de expresión génica y el análisis de proteínas moduladoras inflamatorias e inmunitarias determinadas en muestras de sangre total antes de la cirugía. Se realizará inmunohistoquímica y se evaluará la invasión inflamatoria del tumor según los métodos de Klintrup (12) y el immunoscore (13). Estos métodos se basan en un sistema de puntuación que define el punto más profundo de invasión de células inflamatorias identificadas a partir de portaobjetos de hematoxilina y eosina.

Métodos

Perfiles de expresión génica en sangre total:

Las muestras de sangre se recolectarán en tubos de genes PAX y se enviarán para su análisis en el Hospital Universitario de Odense, Departamento de Genética Clínica. El ARN total se extraerá con el kit Paxgene Blood RNA (Qiagen, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) y la calidad del ARN se evaluará con el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). El kit de amplificación de ARN Message-AmpTM III (Ambion, Austin, TX) se utilizará para convertir el ARN total en ARNa marcado con biotina. El ARNa marcado se hibridará con chips Affymetrix HGU133 Plus 2.0. El preprocesamiento de datos se realizará en el entorno R utilizando una sólida medida de expresión promedio (rma) de múltiples matrices para realizar la corrección de fondo, la normalización y el cálculo del índice de expresión de todas las micromatrices. El análisis de alto nivel adicional incluirá métodos avanzados para datos de alta dimensión, incluidos métodos supervisados ​​y no supervisados. Se calcularán los cambios de pliegue y se utilizará el análisis de significación de Microarray (SAM) y la prueba t para identificar genes expresados ​​diferencialmente, las muestras y la corrección para las pruebas de hipótesis múltiples se realizará mediante el método FDR. Se aplicará el análisis de vías para identificar los mecanismos biológicos activados por la manipulación quirúrgica, utilizando el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA, Broad Institute).

Valoración de marcadores inflamatorios e inmunológicos:

Cuando se hayan recolectado todas las muestras, parte del plasma y suero del biobanco se utilizará para medir las concentraciones de TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ y HLA-G por ELISA en un instrumento ELISA BEP2000 (Siemens Healthcare, Erlangen, Alemania) en los hospitales de Roskilde, Departamento de Bioquímica Clínica, donde tienen mucha experiencia con estas medidas.

Análisis de subpoblaciones leucocitarias:

La inmunofenotipificación multicolor de las subpoblaciones de leucocitos se realizará dentro de 1 a 2 horas después de que se hayan extraído las muestras de sangre. El análisis se realizará mediante el uso de instrumentos BD FACS Canto II (BD Biosciences, Nueva Jersey, EE. UU.). Este instrumento analiza ocho colores/marcadores por tubo. Mediante el uso de paneles de marcadores específicos, se identificarán las células T reguladoras CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+/CD4+CD25+CD127/dim, las células T reguladoras CD4+HLA-G+, las células supresoras derivadas de mieloides y los subconjuntos de NK. Los resultados se analizarán de acuerdo con la regulación inflamatoria e inmunológica al alza o a la baja en el período comprendido entre el día anterior a la cirugía y hasta 10 días después.

Análisis inmunohistoquímico de muestras tumorales:

La inmunohistoquímica se realizará cuando se hayan recogido todas las muestras. Se analizarán las profundidades de invasión y el número de células que expresan CD4, CD8, CD45RO y GZMB. El análisis se realizará de acuerdo con los métodos de Klintrup, que es un método de puntuación que va de 0 a 3. Una puntuación de 0 indica que no hay aumento de las células inflamatorias en el punto más profundo del margen invasivo del tumor; 1 indica un aumento leve y en parches; 2 indica una reacción inflamatoria prominente y 3 denota un infiltrado inflamatorio florido en forma de copa en el borde invasivo con destrucción frecuente de islas de células cancerosas. Estos puntajes luego se clasifican como grado bajo (0 y 1) y alto (2 y 3).

Células NK Después del aislamiento de la crioconservación de PBMC, la actividad funcional de las células NK se determina in vitro exponiéndolas a células diana sensibles a NK marcadas con cromo. La actividad de las células NK se cuantifica en este ensayo mediante la medición del cromo liberado de los objetivos lisados ​​de células NK.