Réponse au stress immunologique et oxydatif en relation avec la chirurgie du cancer de l'abdomen (IMOX)

Arrière-plan

La période périopératoire est relativement courte, mais très critique pour la survie liée au cancer. L'intervention chirurgicale entraîne la libération de cellules tumorales localement et dans le sang, et l'induction d'une réponse au stress chirurgical (SSR). Cela conduit à une paralysie du système immunitaire, à une clairance réduite des cellules cancéreuses et à des conditions optimales pour que les cellules cancéreuses se développent et métastasent(1).

Le cancer colorectal (CCR) est la troisième cause de cancer la plus fréquente au Danemark. En 2013, 4196 patients danois ont reçu un diagnostic de CCR(2) et la norme de soins actuelle comprend une résection tumorale. Cependant, même après une résection tumorale chirurgicale curative attendue, 25 à 30% auront une rechute dans les 5 ans suivant la procédure primaire.

Pour améliorer les résultats après une intervention chirurgicale contre le cancer, il est crucial de comprendre, en détail, comment la RSS affecte la réponse immunitaire et comment la RSS affecte la capacité des cellules cancéreuses à se développer et à métastaser. En effectuant le profilage de l'expression de plus de 40 000 gènes dans le sang total avant et après la chirurgie, nous obtiendrons une signature génétique des gènes des cellules immunitaires circulantes, y compris les granulocytes, les monocytes, les cellules B et T, les cellules dendritiques et les plaquettes, ce qui nous permettra de voir l'impact exact de la chirurgie sur la transcription génique de ces facteurs immunologiques. En utilisant ces informations, des interventions périopératoires peuvent être réalisées pour optimiser la réponse immunologique dans la période périopératoire, entraînant une réduction du risque de récidive du cancer et par conséquent une amélioration de la survie (3).

Réponse chirurgicale au stress (SSR) Il est bien connu qu'une intervention chirurgicale induit une perturbation de l'équilibre immunologique et inflammatoire, provoquant une réponse inflammatoire systémique (4), une immunosuppression (4,5) et un excès d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) (6 ,7). L'inflammation systémique favorise la croissance tumorale (8), et chez les patients qui ont subi une résection potentiellement curative pour un cancer colorectal, la présence d'une réponse inflammatoire systémique prédit un mauvais résultat (3). La paralysie du système immunitaire comprend une activité réduite des cellules NK et des macrophages, qui, dans des circonstances normales, protègent contre les métastases en éliminant les cellules tumorales en dissémination. Un excès de ROS provoque des dommages à l'ADN, la dégradation de la matrice extracellulaire et l'élimination des adhérences cellule-cellule (5,6,7). De cette manière, la chirurgie favorise des conditions optimales pour que les cellules cancéreuses se développent et métastasent dans la phase postopératoire. Des recherches récentes montrent que les cellules immunitaires et leur invasion de la tumeur primaire sont corrélées au pronostic du patient, suggérant à nouveau que la réponse immunitaire est importante pour l'inhibition de la croissance du cancer(9,10). Les informations détaillées sur les modifications génétiques des différents facteurs de la réponse immunitaire dues à la chirurgie restent floues.

Conception de l'étude Le projet consiste en une étude clinique prospective exploratoire incluant 30 patients subissant une hémi-colectomie élective en raison d'un cancer du côlon stade UICC II-III. Des échantillons de sang seront prélevés la veille de la chirurgie et les jours postopératoires 1, 2, 3 et 10. Des échantillons seront préparés pour l'analyse par cytométrie en flux, la banque biologique, la cryoconservation et le profilage génomique du sang total.

Le profilage de l'expression génique du sang total sera réalisé et analysé afin de déterminer les changements transcriptionnels possibles dans les gènes codant pour les facteurs immunologiques, inflammatoires et liés au stress oxydatif causés par la chirurgie. Il est possible de faire une mesure à la fois quantitative et qualitative de ces changements génétiques (11). Les gènes qui sont significativement dérégulés et qui ont été décrits dans des études antérieures, dans le domaine de l'inflammation, du stress immunologique et oxydatif, seront choisis pour une analyse plus approfondie. Des exemples de gènes exacts dans le domaine de l'immunologie et de l'inflammation seront les gènes codant pour TNFα, IL-lb, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ et HLA-G. Au sein des gènes oxydatifs et antioxydants, un accent particulier sera mis sur FoxO3, TP53 et ATM car l'inactivation de ceux-ci est associée à des niveaux accrus de ROS. La régulation à la hausse d'ATOX1, DEFB122 et GBX8 est associée à des niveaux accrus de ROS et sera également choisie pour une analyse plus approfondie (19-21).

Altérations de protéines modulatrices inflammatoires et immunitaires spécifiques (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ et HLA-G), l'activité fonctionnelle des cellules tueuses naturelles (NK) et les fractions et nombres absolus de sous-populations spécifiques de cellules immunitaires (cellules T régulatrices CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim, cellules T régulatrices CD4+HLA-G+, cellules suppressives dérivées de myéloïdes et sous-ensembles NK ) seront identifiés. Les résultats de l'analyse de la transcription génétique et de l'analyse des altérations des protéines inflammatoires et immunomodulatrices seront comparés afin de donner un aperçu complet de la SSR et de l'effet de la chirurgie sur les facteurs immunologiques, oxydatifs et inflammatoires, afin d'évaluer le potentiel cancérogène. effet de la chirurgie, et les moments et les méthodes d'intervention optimale dans ce processus dommageable.

Des échantillons de tumeurs des 30 patients inscrits seront analysés pour le niveau d'invasion des cellules immunologiques. Les résultats seront corrélés aux résultats du profilage de l'expression génique et de l'analyse des protéines modulatrices inflammatoires et immunitaires déterminées dans des échantillons de sang total avant la chirurgie. Une immunohistochimie sera réalisée et l'envahissement inflammatoire de la tumeur sera évalué selon les méthodes de Klintrup (12) et l'immunoscore (13). Ces méthodes sont basées sur un système de notation définissant le point le plus profond d'invasion des cellules inflammatoires identifié à partir de lames d'hématoxyline et d'éosine.

Méthodes

Profilage de l'expression génique dans le sang total :

Des échantillons de sang seront prélevés dans des tubes à gène PAX et envoyés pour analyse à l'hôpital universitaire d'Odense, département de génétique clinique. L'ARN total sera extrait à l'aide du kit Paxgene Blood RNA (Qiagen, Franklin Lakes, NJ, USA) et la qualité de l'ARN sera testée à l'aide du bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Le kit d'amplification d'ARN Message-AmpTM III (Ambion, Austin, TX) sera utilisé pour convertir l'ARN total en ARNa marqué à la biotine. L'ARNa marqué sera hybridé aux puces Affymetrix HGU133 Plus 2.0. Le prétraitement des données sera effectué dans l'environnement R à l'aide d'une mesure d'expression moyenne multi-réseaux (rma) robuste pour effectuer la correction de fond, la normalisation et le calcul de l'indice d'expression de tous les microréseaux. D'autres analyses de haut niveau comprendront des méthodes avancées pour les données de grande dimension, y compris des méthodes supervisées et non supervisées. Les changements de pli seront calculés et l'analyse de signification du microréseau (SAM) et le test t seront utilisés pour identifier les gènes exprimés de manière différentielle, les échantillons et la correction pour les tests d'hypothèses multiples seront effectués à l'aide de la méthode FDR. L'analyse des voies sera appliquée pour identifier les mécanismes biologiques activés par la manipulation chirurgicale, en utilisant Gene Set Enrichment Analysis (GSEA, Broad Institute).

Bilan des marqueurs inflammatoires et immunologiques :

Lorsque tous les échantillons auront été collectés, une partie du plasma et du sérum de la biobanque sera utilisée pour mesurer les concentrations de TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ et HLA-G par ELISA sur un instrument ELISA BEP2000 (Siemens Healthcare, Erlangen, Allemagne) aux hôpitaux Roskilde, Dept.of Biochimie clinique, où ils ont beaucoup d'expérience avec ces mesures.

Analyse des sous-populations de leucocytes :

L'immunophénotypage multicolore des sous-populations de leucocytes sera effectué dans les 1 à 2 heures suivant le prélèvement des échantillons de sang. L'analyse sera effectuée à l'aide d'instruments BD FACS Canto II (BD Biosciences, New Jersey, États-Unis). Cet instrument analyse huit couleurs/marqueurs par tube. Grâce à l'utilisation de panels de marqueurs spécifiques, les lymphocytes T régulateurs CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim, les lymphocytes T régulateurs CD4+HLA-G+, les cellules suppressives dérivées de myéloïdes et les sous-ensembles NK seront identifiés. Les résultats seront analysés en fonction de la régulation inflammatoire et immunologique à la hausse ou à la baisse dans la période allant de la veille de l'intervention chirurgicale jusqu'à 10 jours après.

Analyse immunohistochimique de spécimens tumoraux :

L'immunohistochimie sera effectuée lorsque tous les échantillons auront été prélevés. Les profondeurs d'invasion et le nombre de cellules exprimant CD4, CD8, CD45RO et GZMB seront analysés. L'analyse sera effectuée selon les méthodes de Klintrup, qui est une méthode de notation allant de 0 à 3. Un score de 0 indique l'absence d'augmentation des cellules inflammatoires au point le plus profond de la marge invasive des tumeurs ; 1 indique une augmentation légère et inégale ; 2 indique une réaction inflammatoire proéminente et 3 désigne un infiltrat inflammatoire en forme de coupe fleuri au bord invasif avec destruction fréquente des îlots de cellules cancéreuses. Ces notes sont ensuite classées en notes basses (0 et 1) et hautes (2 et 3).

Cellules NK Après isolement après cryoconservation des PBMC, l'activité fonctionnelle des cellules NK est déterminée in vitro en les exposant à des cellules cibles sensibles aux NK marquées au chrome. L'activité des cellules NK est quantifiée dans ce test par la mesure du chrome libéré par les cibles lysées par les cellules NK.