Resposta Imunológica e Oxidativa ao Estresse em Relação à Cirurgia de Câncer Abdominal (IMOX)

Fundo

O período perioperatório é relativamente curto, mas altamente crítico para a sobrevivência relacionada ao câncer. O procedimento cirúrgico resulta na liberação de células tumorais localmente e no sangue e na indução de uma resposta ao estresse cirúrgico (SSR). Isso leva à paralisia do sistema imunológico, redução da depuração das células cancerígenas e condições ideais para o crescimento e a metástase das células cancerígenas(1).

O câncer colorretal (CCR) é a terceira causa mais comum de câncer na Dinamarca. Em 2013, 4.196 pacientes dinamarqueses foram diagnosticados com CRC(2) e o padrão de tratamento atual inclui a ressecção do tumor. No entanto, mesmo após uma esperada ressecção cirúrgica curativa do tumor, 25-30% terão uma recidiva dentro de 5 anos após o procedimento primário.

Para melhorar o resultado após a cirurgia de câncer, é crucial entender, em detalhes, como o SSR afeta a resposta imune e como o SSR afeta a capacidade das células cancerígenas de crescer e metástase. Ao realizar o perfil de expressão de mais de 40.000 genes em sangue total antes e depois da cirurgia, obteremos uma assinatura genética de genes de células imunes circulantes, incluindo granulócitos, monócitos, células B e T, células dendríticas e plaquetas, o que nos permitirá veja o impacto exato que a cirurgia tem na transcrição gênica desses fatores imunológicos. Com o uso dessas informações, intervenções perioperatórias podem ser realizadas para otimizar a resposta imunológica no período perioperatório, levando à redução do risco de recorrência do câncer e, consequentemente, melhora da sobrevida (3).

Resposta ao estresse cirúrgico (SSR) É bem conhecido que um procedimento cirúrgico induz um distúrbio do equilíbrio imunológico e inflamatório, causando uma resposta inflamatória sistêmica (4), supressão imunológica (4,5) e excesso de espécies reativas de oxigênio (ROS) (6 ,7). A inflamação sistêmica promove o crescimento do tumor (8) e, em pacientes submetidos a ressecção potencialmente curativa para câncer colorretal, a presença de uma resposta inflamatória sistêmica prediz um resultado ruim (3). A paralisia do sistema imunológico inclui atividade reduzida de células NK e macrófagos, os quais, em circunstâncias normais, protegem contra a metástase, eliminando as células tumorais disseminadas. O excesso de ERO causa dano ao DNA, quebra da matriz extracelular e eliminação de aderências célula-célula (5,6,7). Desta forma, a cirurgia promove condições ideais para que as células cancerígenas cresçam e metastatizem na fase pós-operatória. Pesquisas recentes mostram que as células imunes e sua invasão do tumor primário se correlacionam com o prognóstico do paciente, novamente sugerindo que a resposta imune é importante para a inibição do crescimento do câncer(9,10). Informações detalhadas sobre alterações genéticas em diferentes fatores da resposta imune devido à cirurgia ainda não estão claras.

Desenho do estudo O projeto consiste em um estudo clínico prospectivo exploratório incluindo 30 pacientes submetidos a hemicolectomia eletiva devido a câncer de cólon UICC estádio II-III. Amostras de sangue serão coletadas no dia anterior à cirurgia e no dia 1, 2, 3 e 10 do pós-operatório. As amostras serão preparadas para análise de citometria de fluxo, biobanking, criopreservação e perfil genômico de sangue total.

O perfil de expressão gênica de sangue total será realizado e analisado para determinar possíveis alterações transcricionais em genes que codificam fatores imunológicos, inflamatórios e relacionados ao estresse oxidativo causados ​​pela cirurgia. É possível fazer medições quantitativas e qualitativas dessas alterações genéticas (11). Os conjuntos de sondas que são expressos diferencialmente de forma mais significativa antes e depois da cirurgia serão escolhidos para análise posterior. Genes significativamente desregulados e descritos em estudos anteriores, no campo da inflamação, estresse imunológico e oxidativo, serão escolhidos para posterior análise. Exemplos de genes exatos em imunologia e inflamação serão genes que codificam para TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ e HLA-G. Dentro dos genes oxidativos e antioxidantes, ênfase especial será dada em FoxO3, TP53 e ATM, pois a inativação destes está associada ao aumento dos níveis de ERO. A regulação positiva de ATOX1, DEFB122 e GBX8 está associada ao aumento dos níveis de ROS e também será escolhida para análise posterior (19-21).

Alterações nas proteínas inflamatórias e imunomoduladoras específicas (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ e HLA-G), na atividade funcional das células natural killer (NK) e nas frações e números absolutos de subpopulações específicas de células imunes (CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127/células T regulatórias dim, células T regulatórias CD4+HLA-G+, células supressoras derivadas de mieloides e subconjuntos NK ) serão identificados. Os resultados da análise da transcrição genética e da análise das alterações nas proteínas inflamatórias e imunomoduladoras serão comparados a fim de fornecer uma visão geral completa do SSR e do efeito da cirurgia nos fatores imunológicos, oxidativos e inflamatórios, a fim de avaliar o potencial carcinogênico efeito da cirurgia e tempos e métodos de intervenção ideal neste processo prejudicial.

Amostras tumorais dos 30 pacientes inscritos serão analisadas quanto ao nível de invasão de células imunológicas. Os resultados serão correlacionados com os resultados do perfil de expressão gênica e análise de proteínas inflamatórias e imunomoduladoras determinadas em amostras de sangue total antes da cirurgia. Será realizada imunohistoquímica e a invasão inflamatória do tumor será avaliada segundo os métodos de Klintrup (12) e o imunoscore (13). Esses métodos são baseados em um sistema de pontuação que define o ponto mais profundo de invasão de células inflamatórias identificadas em lâminas de hematoxilina e eosina.

Métodos

Perfil de expressão gênica de sangue total:

Amostras de sangue serão coletadas em tubos PAX-gene e enviadas para análise no Odense University Hospital, Dept. of Clinical Genetics. O RNA total será extraído usando o kit Paxgene Blood RNA (Qiagen, Franklin Lakes, NJ, EUA) e a qualidade do RNA será testada usando o Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). O kit de amplificação de RNA Message-AmpTM III (Ambion, Austin, TX) será usado para converter o RNA total em aRNA marcado com biotina. O aRNA marcado será hibridizado com os chips Affymetrix HGU133 Plus 2.0. O pré-processamento de dados será feito no ambiente R usando medida de expressão média multi-array robusta (rma) para executar correção de fundo, normalização e cálculo do índice de expressão de todos os microarrays. Outras análises de alto nível incluirão métodos avançados para dados de alta dimensão, incluindo métodos supervisionados e não supervisionados. As mudanças nas dobras serão calculadas e a análise de significância de Microarray (SAM) e o teste t serão usados ​​para identificar genes expressos diferencialmente, amostras e correção para testes de hipóteses múltiplas serão realizadas usando o método FDR. A análise de vias será aplicada para identificar os mecanismos biológicos ativados pela manipulação cirúrgica, usando Gene Set Enrichment Analysis (GSEA, Broad Institute).

Avaliação de marcadores inflamatórios e imunológicos:

Quando todas as amostras forem coletadas, parte do plasma e soro do biobanco será utilizada para medição das concentrações de TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ e HLA-G por ELISAs em um instrumento ELISA BEP2000 (Siemens Healthcare, Erlangen, Alemanha) nos Hospitais Roskilde, Departamento de Bioquímica Clínica, onde têm muita experiência com estas medidas.

Análise de subpopulações de leucócitos:

A imunofenotipagem multicolorida de subpopulações de leucócitos será realizada dentro de 1-2 horas após a coleta das amostras de sangue. A análise será feita com o uso de instrumentos BD FACS Canto II (BD Biosciences, New Jersey, EUA). Este instrumento analisa oito cores/marcadores por tubo. Através do uso de painéis de marcadores específicos CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127/células T regulatórias dim, células T regulatórias CD4+HLA-G+, células supressoras derivadas de mieloides e subconjuntos NK serão identificados. Os resultados serão analisados ​​de acordo com a regulação inflamatória e imunológica no período de um dia antes da cirurgia e até 10 dias após.

Análise imuno-histoquímica de espécimes tumorais:

A imuno-histoquímica será realizada quando todas as amostras tiverem sido coletadas. Profundidades de invasão e número de células expressando CD4, CD8, CD45RO e GZMB serão analisados. A análise será realizada de acordo com os métodos de Klintrup, que é um método de pontuação que varia de 0-3. Uma pontuação de 0 indica nenhum aumento nas células inflamatórias no ponto mais profundo da margem invasiva do tumor; 1 indica um aumento leve e irregular; 2 indica uma reação inflamatória proeminente e 3 denota um infiltrado inflamatório florido em forma de taça na borda invasiva com destruição frequente de ilhas de células cancerígenas. Essas pontuações são então classificadas em nota baixa (0 e 1) e alta (2 e 3).

Células NK Após o isolamento af criopreservação de PBMC, a atividade funcional das células NK é determinada in vitro, expondo-as a células-alvo NK sensíveis marcadas com cromo. A atividade das células NK é quantificada neste ensaio pela medição do cromo liberado dos alvos lisados ​​pelas células NK.