Reakce na imunologický a oxidační stres ve vztahu k operaci rakoviny břicha (IMOX)

Pozadí

Peroperační období je relativně krátké, ale vysoce kritické pro přežití související s rakovinou. Výsledkem chirurgického zákroku je uvolnění nádorových buněk lokálně a v krvi a vyvolání chirurgické stresové reakce (SSR). To vede k paralýze imunitního systému, snížené clearance rakovinných buněk a optimálním podmínkám pro růst a metastázování rakovinných buněk(1).

Kolorektální karcinom (CRC) je třetí nejčastější příčinou rakoviny v Dánsku. V roce 2013 bylo diagnostikováno 4196 dánských pacientů s CRC(2) a současný standard péče zahrnuje resekci nádoru. Avšak i po očekávané kurativní chirurgické resekci tumoru dojde u 25–30 % k relapsu do 5 let po primárním výkonu.

Pro zlepšení výsledku po operaci rakoviny je zásadní podrobně porozumět tomu, jak SSR ovlivňuje imunitní odpověď a jak SSR ovlivňuje schopnost rakovinných buněk růst a metastázovat. Provedením expresního profilování více než 40 000 genů v plné krvi před a po operaci získáme genetický podpis genů z cirkulujících imunitních buněk, včetně granulocytů, monocytů, B a T buněk, dendritických buněk a krevních destiček, což nám umožní viz přesný dopad operace na genovou transkripci těchto imunologických faktorů. S využitím těchto informací lze provádět perioperační intervence k optimalizaci imunologické odpovědi v perioperačním období, což vede ke snížení rizika recidivy karcinomu a následně ke zlepšení přežití (3).

Chirurgická stresová reakce (SSR) Je dobře známo, že chirurgický zákrok vyvolává poruchu imunologické a zánětlivé rovnováhy, způsobuje systémovou zánětlivou reakci (4), imunitní supresi (4,5) a přebytek reaktivních forem kyslíku (ROS) (6 ,7). Systémový zánět podporuje růst nádoru (8) a u pacientů, kteří podstoupili potenciálně kurativní resekci pro kolorektální karcinom, přítomnost systémové zánětlivé odpovědi předpovídá špatný výsledek (3). Paralýza imunitního systému zahrnuje sníženou aktivitu NK buněk a makrofágů, které oba za normálních okolností chrání před metastázami eliminací diseminujících nádorových buněk. Nadměrné ROS způsobuje poškození DNA, rozpad extracelulární matrix a eliminaci adhezí buňka-buňka (5,6,7). Tímto způsobem chirurgie podporuje optimální podmínky pro růst a metastázování rakovinných buněk v pooperační fázi. Nedávné výzkumy ukazují, že imunitní buňky a jejich invaze do primárního nádoru korelují s prognózou pacienta, což opět naznačuje, že imunitní odpověď je důležitá pro inhibici růstu rakoviny(9,10). Podrobné informace o genetických změnách v různých faktorech imunitní odpovědi v důsledku chirurgického zákroku zůstávají nejasné.

Návrh studie Projekt sestává z klinické prospektivní explorativní studie zahrnující 30 pacientů podstupujících elektivní hemikolektomii pro karcinom tlustého střeva UICC stadia II-III. Vzorky krve budou odebrány den před operací a pooperační den 1, 2, 3 a 10. Budou připraveny vzorky pro analýzu průtokovou cytometrií, biobankovnictví, kryokonzervaci a genomické profilování plné krve.

Bude provedeno a analyzováno profilování genové exprese v plné krvi, aby se určily možné transkripční změny v genech kódujících imunologické, zánětlivé faktory a faktory související s oxidačním stresem způsobené chirurgickým zákrokem. Je možné provést kvantitativní i kvalitativní měření těchto genetických změn (11). K další analýze budou vybrány sady sond, u kterých bude zjištěno, že jsou nejvýrazněji rozdílně exprimovány před a po operaci. Pro další analýzu budou vybrány geny, které jsou významně deregulované a byly popsány v předchozích studiích v oblasti zánětu, imunologického a oxidačního stresu. Příklady přesných genů v rámci imunologie a zánětu budou geny kódující TNFa, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFp a HLA-G. V rámci oxidačních a antioxidačních genů bude zvláštní důraz kladen na FoxO3, TP53 a ATM, protože jejich inaktivace je spojena se zvýšenými hladinami ROS. Upregulace ATOX1, DEFB122 a GBX8 je spojena se zvýšenými hladinami ROS a bude také vybrána pro další analýzu (19-21).

Změny specifických zánětlivých a imunomodulačních proteinů (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ a HLA-G), funkční aktivita přirozených zabíječských (NK) buněk a frakcí a absolutní počty specifických subpopulací imunitních buněk (CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim regulační T buňky, CD4+HLA-G+ regulační T buňky, myeloidní supresorové buňky a NK podskupiny ) budou identifikovány. Výsledky z genetické transkripční analýzy a analýzy změn v zánětlivých a imunomodulačních proteinech budou porovnány s cílem poskytnout úplný přehled o SSR a účinku chirurgického zákroku na imunologické, oxidační a zánětlivé faktory, aby bylo možné vyhodnotit potenciální karcinogenní efekt operace a časy a způsoby optimálního zásahu do tohoto poškozujícího procesu.

Vzorky nádorů od 30 zařazených pacientů budou analyzovány na úroveň invaze imunologických buněk. Výsledky budou korelovány s výsledky profilování genové exprese a analýzy zánětlivých a imunomodulačních proteinů stanovených ve vzorcích plné krve před operací. Bude provedena imunohistochemie a bude hodnocena zánětlivá invaze tumoru podle Klintrupových metod (12) a imunoskóre (13). Tyto metody jsou založeny na skórovacím systému definujícím nejhlubší bod invaze zánětlivých buněk identifikovaných z hematoxylinových a eosinových sklíček.

Metody

Profilování genové exprese plné krve:

Vzorky krve budou odebrány do zkumavek s genem PAX a odeslány k analýze do Fakultní nemocnice v Odense, oddělení klinické genetiky. Celková RNA bude extrahována pomocí soupravy Paxgene Blood RNA (Qiagen, Franklin Lakes, NJ, USA) a kvalita RNA bude testována pomocí Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Ke konverzi celkové RNA na biotinem značenou aRNA bude použita souprava pro amplifikaci RNA Message-AmpTM III (Ambion, Austin, TX). Značená aRNA bude hybridizována s čipy Affymetrix HGU133 Plus 2.0. Předzpracování dat bude provedeno v prostředí R s použitím robustní multi-array průměrné míry exprese (rma) k provedení korekce pozadí, normalizace a výpočtu indexu exprese všech mikročipů. Další analýza na vysoké úrovni bude zahrnovat pokročilé metody pro vysokorozměrná data, včetně metod pod dohledem a bez dohledu. Budou vypočítány změny skládání a bude použita analýza významnosti Microarray (SAM) a t-test k identifikaci odlišně exprimovaných genů, vzorků a korekce pro testování více hypotéz pomocí FDR metody. Analýza dráhy bude použita k identifikaci biologických mechanismů aktivovaných chirurgickou manipulací pomocí analýzy obohacování genové sady (GSEA, Broad Institute).

Stanovení zánětlivých a imunologických markerů:

Po odebrání všech vzorků bude část biobanky plazmy a séra použita pro měření koncentrací TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ a HLA-G. ELISA na přístroji BEP2000 ELISA (Siemens Healthcare, Erlangen, Německo) v Roskilde Hospitals, Dept. Klinická biochemie, kde mají s těmito opatřeními bohaté zkušenosti.

Analýza subpopulací lekocytů:

Vícebarevná imunofenotypizace subpopulací leukocytů bude provedena během 1-2 hodin po odběru vzorků krve. Analýza bude provedena pomocí přístrojů BD FACS Canto II (BD Biosciences, New Jersey, USA). Tento přístroj analyzuje osm barev/značek na zkumavku. Pomocí specifických panelů markerů budou identifikovány CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127/dim regulační T buňky, CD4+HLA-G+ regulační T buňky, supresorové buňky odvozené od myeloidů a NK podskupiny. Výsledky budou analyzovány podle zánětlivých a imunologických up nebo down regulací v období od dne před operací a do 10 dnů po.

Imunohistochemická analýza vzorků nádorů:

Imunohistochemie bude provedena po odebrání všech vzorků. Bude analyzována hloubka invaze a počet buněk exprimujících CD4, CD8, CD45RO a GZMB. Analýza bude provedena podle Klintrupových metod, což je metoda bodování v rozmezí 0-3. Skóre 0 indikuje žádné zvýšení zánětlivých buněk v nejhlubším bodě invazivního okraje nádoru; 1 ukazuje mírný a nerovnoměrný nárůst; 2 označuje výraznou zánětlivou reakci a 3 označuje floridní pohárovitý zánětlivý infiltrát na invazivním okraji s častou destrukcí ostrůvků rakovinných buněk. Tato skóre jsou pak klasifikována jako nízká (0 a 1) a vysoká (2 a 3).

NK buňky Po izolaci a kryoprezervaci PBMC je funkční aktivita NK buněk stanovena in vitro jejich vystavením chrómem značeným NK citlivým cílovým buňkám. Aktivita NK buněk se v tomto testu kvantifikuje měřením chrómu uvolněného z cílů lyžovaných NK buňkami.