Immunologische und oxidative Stressreaktion im Zusammenhang mit der Bauchkrebschirurgie (IMOX)

Hintergrund

Der perioperative Zeitraum ist relativ kurz, aber äußerst entscheidend für das Überleben im Zusammenhang mit einer Krebserkrankung. Der chirurgische Eingriff führt zur Freisetzung von Tumorzellen lokal und im Blut und zur Auslösung einer chirurgischen Stressreaktion (SSR). Dies führt zu einer Lähmung des Immunsystems, einer verminderten Clearance von Krebszellen und optimalen Bedingungen für das Wachstum und die Metastasierung von Krebszellen(1).

Darmkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Krebsursache in Dänemark. Im Jahr 2013 wurde bei 4.196 dänischen Patienten CRC(2) diagnostiziert und der aktuelle Behandlungsstandard umfasst eine Tumorresektion. Doch selbst nach einer erwarteten kurativen chirurgischen Tumorresektion erleiden 25–30 % innerhalb von 5 Jahren nach dem primären Eingriff einen Rückfall.

Um das Ergebnis nach einer Krebsoperation zu verbessern, ist es wichtig, im Detail zu verstehen, wie SSR die Immunantwort beeinflusst und wie SSR die Fähigkeit von Krebszellen zum Wachstum und zur Metastasierung beeinflusst. Durch die Durchführung von Expressionsprofilen von über 40.000 Genen im Vollblut vor und nach der Operation erhalten wir eine genetische Signatur von Genen aus zirkulierenden Immunzellen, einschließlich Granulozyten, Monozyten, B- und T-Zellen, dendritischen Zellen und Blutplättchen, was uns dies ermöglicht Sehen Sie sich die genauen Auswirkungen einer Operation auf die Gentranskription dieser immunologischen Faktoren an. Mithilfe dieser Informationen können perioperative Interventionen durchgeführt werden, um die immunologische Reaktion in der perioperativen Phase zu optimieren, was zu einem verringerten Risiko eines erneuten Auftretens von Krebs und folglich zu einer Verbesserung des Überlebens führt (3).

Chirurgische Stressreaktion (SSR) Es ist bekannt, dass ein chirurgischer Eingriff eine Störung des immunologischen und entzündlichen Gleichgewichts hervorruft, was zu einer systemischen Entzündungsreaktion (4), einer Immunsuppression (4,5) und einem Überschuss an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) (6) führt ,7). Eine systemische Entzündung fördert das Tumorwachstum (8), und bei Patienten, die sich einer möglicherweise kurativen Resektion wegen Darmkrebs unterzogen haben, ist das Vorliegen einer systemischen Entzündungsreaktion ein Hinweis auf ein schlechtes Ergebnis (3). Die Lähmung des Immunsystems umfasst eine verminderte Aktivität von NK-Zellen und Makrophagen, die beide unter normalen Umständen vor Metastasierung schützen, indem sie sich ausbreitende Tumorzellen eliminieren. Übermäßige ROS verursachen DNA-Schäden, den Abbau der extrazellulären Matrix und die Beseitigung von Zell-Zell-Adhäsionen (5,6,7). Auf diese Weise schafft die Operation optimale Bedingungen für das Wachstum und die Metastasierung von Krebszellen in der postoperativen Phase. Aktuelle Forschungsergebnisse zeigen, dass Immunzellen und ihre Invasion des Primärtumors mit der Prognose des Patienten korrelieren, was wiederum darauf hindeutet, dass die Immunantwort für die Hemmung des Krebswachstums wichtig ist (9,10). Detaillierte Informationen zu genetischen Veränderungen verschiedener Faktoren der Immunantwort aufgrund einer Operation bleiben unklar.

Studiendesign Das Projekt besteht aus einer klinisch-prospektiven explorativen Studie mit 30 Patienten, die sich einer elektiven Hemikolektomie aufgrund von Darmkrebs im UICC-Stadium II-III unterziehen. Am Tag vor der Operation und am postoperativen Tag 1, 2, 3 und 10 werden Blutproben entnommen. Die Proben werden für die durchflusszytometrische Analyse, das Biobanking, die Kryokonservierung und die Genomprofilierung von Vollblut vorbereitet.

Es wird ein Profil der Genexpression im Vollblut durchgeführt und analysiert, um mögliche Transkriptionsveränderungen in Genen zu bestimmen, die für immunologische, entzündliche und oxidative stressbedingte Faktoren kodieren, die durch eine Operation verursacht werden. Es ist möglich, diese genetischen Veränderungen sowohl quantitativ als auch qualitativ zu messen (11). Für die weitere Analyse werden die Sondensätze ausgewählt, die vor und nach der Operation am deutlichsten unterschiedlich exprimiert werden. Gene, die erheblich dereguliert sind und in früheren Studien im Bereich Entzündung, immunologischer und oxidativer Stress beschrieben wurden, werden für die weitere Analyse ausgewählt. Beispiele für exakte Gene im Bereich Immunologie und Entzündung sind Gene, die für TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ und HLA-G kodieren. Bei den oxidativen und antioxidativen Genen wird ein besonderer Schwerpunkt auf FoxO3, TP53 und ATM gelegt, da deren Inaktivierung mit einem erhöhten ROS-Spiegel verbunden ist. Eine Hochregulierung von ATOX1, DEFB122 und GBX8 ist mit einem erhöhten ROS-Spiegel verbunden und wird ebenfalls für die weitere Analyse ausgewählt (19-21).

Veränderungen in spezifischen entzündlichen und immunmodulierenden Proteinen (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ und HLA-G), der funktionellen Aktivität natürlicher Killerzellen (NK) und deren Fraktionen und absolute Zahlen spezifischer Subpopulationen von Immunzellen (CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+/CD4+CD25+CD127/dim regulatorische T-Zellen, CD4+HLA-G+ regulatorische T-Zellen, myeloische Suppressorzellen und NK-Untergruppen). ) werden identifiziert. Ergebnisse der genetischen Transkriptionsanalyse und der Analyse von Veränderungen in entzündlichen und immunmodulierenden Proteinen werden verglichen, um einen vollständigen Überblick über die SSR und die Auswirkungen der Operation auf immunologische, oxidative und entzündliche Faktoren zu geben und das Potenzial für Karzinogenität zu bewerten Auswirkungen der Operation sowie Zeitpunkte und Methoden eines optimalen Eingriffs in diesen schädlichen Prozess.

Tumorproben der 30 eingeschlossenen Patienten werden auf den Grad der Invasion immunologischer Zellen analysiert. Die Ergebnisse werden mit den Ergebnissen der Genexpressionsprofilierung und Analyse von entzündlichen und immunmodulierenden Proteinen korreliert, die in Vollblutproben vor der Operation bestimmt wurden. Es wird eine Immunhistochemie durchgeführt und die entzündliche Invasion des Tumors wird nach den Methoden von Klintrup (12) und dem Immunscore (13) bewertet. Diese Methoden basieren auf einem Bewertungssystem, das den tiefsten Punkt der Invasion von Entzündungszellen definiert, der anhand von Hämatoxylin- und Eosin-Objektträgern identifiziert wurde.

Methoden

Profilierung der Genexpression im Vollblut:

Blutproben werden in PAX-Genröhrchen gesammelt und zur Analyse an das Odense University Hospital, Abteilung für klinische Genetik, geschickt. Die Gesamt-RNA wird mit dem Paxgene Blood RNA-Kit (Qiagen, Franklin Lakes, NJ, USA) extrahiert und die Qualität der RNA wird mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) getestet. Das Message-AmpTM III RNA-Amplifikationskit (Ambion, Austin, TX) wird verwendet, um Gesamt-RNA in Biotin-markierte aRNA umzuwandeln. Markierte aRNA wird mit Affymetrix HGU133 Plus 2.0-Chips hybridisiert. Die Datenvorverarbeitung erfolgt in einer R-Umgebung unter Verwendung eines robusten Multi-Array-Durchschnittsausdrucksmaßes (RMA), um Hintergrundkorrektur, Normalisierung und Expressionsindexberechnung aller Mikroarrays durchzuführen. Weitere High-Level-Analysen umfassen fortgeschrittene Methoden für hochdimensionale Daten, einschließlich überwachter und unüberwachter Methoden. Faltungsänderungen werden berechnet und die Signifikanzanalyse von Microarray (SAM) und T-Test wird verwendet, um unterschiedlich exprimierte Gene zu identifizieren. Proben und Korrekturen für Tests mehrerer Hypothesen werden mithilfe der FDR-Methode durchgeführt. Mithilfe einer Pathway-Analyse (GSEA, Broad Institute) werden die durch die chirurgische Manipulation aktivierten biologischen Mechanismen mithilfe der Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) identifiziert.

Beurteilung entzündlicher und immunologischer Marker:

Wenn alle Proben gesammelt wurden, wird ein Teil des biobankierten Plasmas und Serums zur Messung der Konzentrationen von TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ und HLA-G verwendet ELISAs auf einem BEP2000 ELISA-Gerät (Siemens Healthcare, Erlangen, Deutschland) im Roskilde Hospitals, Abt Klinische Biochemie, wo sie viel Erfahrung mit diesen Maßnahmen haben.

Analyse von Lekozyten-Subpopulationen:

Die mehrfarbige Immunphänotypisierung von Leukozyten-Subpopulationen wird innerhalb von 1–2 Stunden nach der Blutentnahme durchgeführt. Die Analyse erfolgt mithilfe von BD FACS Canto II-Instrumenten (BD Biosciences, New Jersey, USA). Dieses Instrument analysiert acht Farben/Marker pro Tube. Durch die Verwendung spezifischer Markerpanels werden CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim regulatorische T-Zellen, CD4+HLA-G+ regulatorische T-Zellen, myeloid-abgeleitete Suppressorzellen und NK-Untergruppen identifiziert. Die Ergebnisse werden nach entzündlicher und immunologischer Auf- oder Abwärtsregulation im Zeitraum vom Tag vor der Operation bis zu 10 Tagen danach analysiert.

Immunhistochemische Analyse von Tumorproben:

Die Immunhistochemie wird durchgeführt, wenn alle Proben gesammelt wurden. Die Invasionstiefen und die Anzahl der Zellen, die CD4, CD8, CD45RO und GZMB exprimieren, werden analysiert. Die Analyse wird nach den Klintrup-Methoden durchgeführt, bei denen es sich um eine Bewertungsmethode im Bereich von 0 bis 3 handelt. Ein Wert von 0 bedeutet, dass die Entzündungszellen am tiefsten Punkt des invasiven Randes des Tumors nicht zunehmen; 1 weist auf einen leichten und fleckigen Anstieg hin; 2 weist auf eine ausgeprägte Entzündungsreaktion hin und 3 bezeichnet ein florides, becherartiges Entzündungsinfiltrat am invasiven Rand mit häufiger Zerstörung von Krebszellinseln. Diese Ergebnisse werden dann in niedrige (0 und 1) und hohe (2 und 3) Noten eingeteilt.

NK-Zellen Nach der Isolierung durch Kryokonservierung von PBMCs wird die funktionelle Aktivität von NK-Zellen in vitro bestimmt, indem sie mit Chrom markierten NK-empfindlichen Zielzellen ausgesetzt werden. Die NK-Zellaktivität wird in diesem Assay durch die Messung von Chrom quantifiziert, das von NK-Zell-lysierten Zielen freigesetzt wird.