Immunologisk och oxidativ stressrespons i relation till bukcancerkirurgi (IMOX)

Bakgrund

Den perioperativa perioden är relativt kort, men mycket kritisk för cancerrelaterad överlevnad. Det kirurgiska ingreppet resulterar i frisättning av tumörceller lokalt och i blodet, och induktion av en kirurgisk stressrespons (SSR). Detta leder till förlamning av immunsystemet, minskad clearance av cancerceller och optimala förutsättningar för cancerceller att växa och metastasera(1).

Kolorektal cancer (CRC) är den tredje vanligaste cancerorsaken i Danmark. Under 2013 diagnostiserades 4196 danska patienter med CRC(2) och den nuvarande standarden för vård inkluderar en tumörresektion. Men även efter en förväntad kurativ kirurgisk tumörresektion kommer 25-30% att få ett återfall inom 5 år efter det primära ingreppet.

För att förbättra resultatet efter operation för cancer är det avgörande att i detalj förstå hur SSR påverkar immunsvaret och hur SSR påverkar cancercellernas förmåga att växa och metastasera. Genom att utföra uttrycksprofilering av över 40 000 gener i helblod före och efter operationen kommer vi att få en genetisk signatur av gener från cirkulerande immunceller, inklusive granulocyter, monocyter, B- och T-celler, dendritiska celler och blodplättar, vilket gör det möjligt för oss att se den exakta inverkan kirurgi har på gentranskriptionen av dessa immunologiska faktorer. Genom att använda denna information kan perioperativa ingrepp utföras för att optimera det immunologiska svaret i den perioperativa perioden, vilket leder till minskad risk för cancerrecidiv och följaktligen förbättrad överlevnad (3).

Kirurgisk stressrespons (SSR) Det är välkänt att ett kirurgiskt ingrepp inducerar en störning av den immunologiska och inflammatoriska balansen, vilket orsakar ett systemiskt inflammatoriskt svar (4), immunsuppression (4,5) och överskott av reaktiva syrearter (ROS) (6 ,7). Systemisk inflammation främjar tumörtillväxt (8), och hos patienter som har genomgått potentiellt botande resektion för kolorektal cancer förutsäger närvaron av ett systemiskt inflammatoriskt svar ett dåligt resultat (3). Förlamningen av immunsystemet inkluderar minskad aktivitet av NK-celler och makrofager, som båda under normala omständigheter skyddar mot metastaser genom att eliminera spridande tumörceller. Överdriven ROS orsakar DNA-skada, nedbrytning av extracellulär matris och eliminering av cell-celladhesion (5,6,7). På så sätt främjar kirurgi optimala förutsättningar för cancerceller att växa och metastasera i den postoperativa fasen. Ny forskning visar att immunceller och deras invasion av den primära tumören korrelerar med patientens prognos, vilket återigen antyder att immunsvaret är viktigt för hämning av cancertillväxt(9,10). Detaljerad information om genetiska förändringar i olika faktorer av immunsvaret på grund av operation är fortfarande oklar.

Studiedesign Projektet består av en klinisk prospektiv explorativ studie innefattande 30 patienter som genomgår elektiv hemikolektomi på grund av tjocktarmscancer UICC stadium II-III. Blodprover kommer att tas dagen före operationen och på dag 1, 2, 3 och 10 efter operationen. Prover kommer att förberedas för flödescytometrisk analys, biobanking, kryokonservering och genomisk helblodsprofilering.

Helblodsgenexpressionsprofilering kommer att utföras och analyseras för att fastställa möjliga transkriptionsförändringar i gener som kodar för immunologiska, inflammatoriska och oxidativ stressrelaterade faktorer orsakade av kirurgi. Det är möjligt att göra både en kvantitativ och kvalitativ mätning av dessa genetiska förändringar (11). De sonduppsättningar som visar sig vara de mest signifikanta differentiellt uttryckta före och efter operationen kommer att väljas för vidare analys. Gener som är väsentligt avreglerade och har beskrivits i tidigare studier, inom området inflammation, immunologisk och oxidativ stress, kommer att väljas ut för vidare analys. Exempel på exakta gener inom immunologi och inflammation kommer att vara gener som kodar för TNFa, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ och HLA-G. Inom oxidativa och antioxidativa gener kommer särskild tonvikt att läggas på FoxO3, TP53 och ATM då inaktivering av dessa är förknippad med ökade nivåer av ROS. Uppreglering av ATOX1, DEFB122 och GBX8 är associerad med ökade nivåer av ROS, och kommer även att väljas för vidare analys (19-21).

Förändringar i specifika inflammatoriska och immunmodulerande proteiner (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ och HLA-G), den funktionella aktiviteten hos naturliga mördarceller (NK) och fraktionerna och absoluta antal specifika subpopulationer av immunceller (CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+/CD4+CD25+CD127/dim regulatoriska T-celler, CD4+HLA-G+ regulatoriska T-celler, myeloid-härledda suppressorceller och NK-undergrupper ) kommer att identifieras. Resultat från genetisk transkriptionsanalys och analys av förändringar i inflammatoriska och immunmodulerande proteiner kommer att jämföras för att ge en fullständig översikt över SSR, och effekten av kirurgi på immunologiska, oxidativa och inflammatoriska faktorer, för att utvärdera den potentiella cancerogena effekten effekt av operation, och tider och metoder för optimal intervention i denna skadliga process.

Tumörprover från de 30 inskrivna patienterna kommer att analyseras med avseende på graden av invasion av immunologiska celler. Resultaten kommer att korreleras med resultaten från genuttrycksprofilering och analys av inflammatoriska och immunmodulerande proteiner som bestämts i helblodsprover före operation. Immunhistokemi kommer att utföras och inflammatorisk invasion av tumören kommer att utvärderas enligt Klintrups metoder (12) och immunoscore (13). Dessa metoder är baserade på ett poängsystem som definierar den djupaste punkten för invasion av inflammatoriska celler identifierade från hematoxylin- och eosinglas.

Metoder

Helblodsgenexpressionsprofilering:

Blodprover kommer att samlas in i PAX-genrör och skickas för analys på Odense Universitetssjukhus, Avd för klinisk genetik. Totalt RNA kommer att extraheras med Paxgene Blood RNA kit (Qiagen, Franklin Lakes, NJ, USA) och kvaliteten på RNA kommer att testas med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Message-AmpTM III RNA-förstärkningskit (Ambion, Austin, TX) kommer att användas för att omvandla totalt RNA till biotinmärkt aRNA. Märkt aRNA kommer att hybridiseras till Affymetrix HGU133 Plus 2.0-chips. Dataförbearbetning kommer att göras i R-miljö med hjälp av robust multi-array-medeluttrycksmått (rma) för att utföra bakgrundskorrigering, normalisering och uttrycksindexberäkning av alla mikroarrayer. Ytterligare högnivåanalyser kommer att innefatta avancerade metoder för högdimensionell data inklusive övervakade och oövervakade metoder. Vikförändringar kommer att beräknas och signifikansanalys av Microarray (SAM) och t-test kommer att användas för att identifiera differentiellt uttryckta gener, prover och korrigering för multipel hypotestestning kommer att utföras med FDR-metoden. Väganalys kommer att tillämpas för att identifiera de biologiska mekanismer som aktiveras av den kirurgiska manipulationen, med hjälp av Gene Set Enrichment Analysis (GSEA, Broad Institute).

Bedömning av inflammatoriska och immunologiska markörer:

När alla prover har samlats in kommer en del av den biobankade plasman och serumet att användas för mätning av koncentrationer av TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ och HLA-G genom att ELISA på ett BEP2000 ELISA-instrument (Siemens Healthcare, Erlangen, Tyskland) vid Roskilde Hospital, Dept.of Clinical Biochemistry, där de har stor erfarenhet av dessa åtgärder.

Analys av lekocytsubpopulationer:

Flerfärgsimmunfenotypning av leukocytsubpopulationer kommer att utföras inom 1-2 timmar efter att blodprover har tagits. Analys kommer att göras med hjälp av BD FACS Canto II-instrument (BD Biosciences, New Jersey, USA). Detta instrument analyserar åtta färger/markörer per tub. Genom användning av specifika markörpaneler kommer CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+/CD4+CD25+CD127/dim regulatoriska T-celler, CD4+HLA-G+ regulatoriska T-celler, myeloidhärledda suppressorceller och NK-undergrupper att identifieras. Resultat kommer att analyseras enligt inflammatorisk och immunologisk upp- eller nedreglering under perioden från dagen före operationen och upp till 10 dagar efter.

Immunhistokemisk analys av tumörprover:

Immunhistokemi kommer att utföras när alla prover har samlats in. Invasionsdjup och antal celler som uttrycker CD4, CD8, CD45RO och GZMB kommer att analyseras. Analysen kommer att utföras enligt Klintrups metoder, vilket är en poängmetod som sträcker sig från 0-3. En poäng på 0 indikerar ingen ökning av de inflammatoriska cellerna vid den djupaste punkten av tumörens invasiva marginal; 1 indikerar en mild och fläckvis ökning; 2 indikerar en framträdande inflammatorisk reaktion, och 3 betecknar ett florid koppliknande inflammatoriskt infiltrat vid den invasiva kanten med frekvent förstörelse av cancercellsöar. Dessa poäng klassificeras sedan som låga (0 och 1) och höga (2 och 3) betyg.

NK-celler Efter isolering av kryokonservering av PBMC bestäms den funktionella aktiviteten av NK-celler in vitro genom att exponera dem för krommärkta NK-känsliga målceller. NK-cellaktivitet kvantifieras i denna analys genom mätning av krom frisatt från NK-celllyserade mål.