Иммунологический и окислительный стресс в связи с операцией по поводу рака брюшной полости (IMOX)

Фон

Периоперационный период относительно короткий, но очень важный для выживания, связанного с раком. Хирургическая процедура приводит к высвобождению опухолевых клеток локально и в кровь, а также к индукции реакции на хирургический стресс (SSR). Это приводит к параличу иммунной системы, снижению клиренса раковых клеток и созданию оптимальных условий для роста и метастазирования раковых клеток (1).

Колоректальный рак (КРР) является третьей наиболее распространенной причиной рака в Дании. В 2013 г. у 4196 датских пациентов был диагностирован КРР(2), и текущий стандарт лечения включает резекцию опухоли. Тем не менее, даже после ожидаемой лечебной хирургической резекции опухоли у 25-30% будет рецидив в течение 5 лет после первичной процедуры.

Чтобы улучшить результаты после операции по поводу рака, крайне важно в деталях понять, как SSR влияет на иммунный ответ и как SSR влияет на способность раковых клеток расти и метастазировать. Выполняя профилирование экспрессии более 40 000 генов в цельной крови до и после операции, мы получим генетическую подпись генов из циркулирующих иммунных клеток, включая гранулоциты, моноциты, В- и Т-клетки, дендритные клетки и тромбоциты, что позволит нам увидеть точное влияние операции на транскрипцию генов этих иммунологических факторов. Используя эту информацию, можно проводить периоперационные вмешательства для оптимизации иммунологического ответа в периоперационном периоде, что приводит к снижению риска рецидива рака и, следовательно, к улучшению выживаемости (3).

Реакция на хирургический стресс (ССР) Хорошо известно, что хирургическая процедура вызывает нарушение иммунологического и воспалительного баланса, вызывая системную воспалительную реакцию (4), подавление иммунитета (4,5) и избыток активных форм кислорода (АФК) (6). ,7). Системное воспаление способствует росту опухоли (8), а у пациентов, перенесших потенциально излечивающую резекцию по поводу колоректального рака, наличие системной воспалительной реакции предсказывает неблагоприятный исход (3). Паралич иммунной системы включает снижение активности NK-клеток и макрофагов, которые в нормальных условиях защищают от метастазирования, устраняя диссеминирующие опухолевые клетки. Чрезмерное количество АФК вызывает повреждение ДНК, разрушение внеклеточного матрикса и устранение межклеточных спаек (5,6,7). Таким образом, операция создает оптимальные условия для роста и метастазирования раковых клеток в послеоперационном периоде. Недавние исследования показывают, что иммунные клетки и их инвазия в первичную опухоль коррелируют с прогнозом пациента, что еще раз свидетельствует о том, что иммунный ответ важен для подавления роста рака (9,10). Подробная информация о генетических изменениях различных факторов иммунного ответа вследствие операции остается неясной.

Дизайн исследования Проект состоит из клинического проспективного исследовательского исследования, включающего 30 пациентов, перенесших плановую гемиколэктомию по поводу рака толстой кишки UICC стадии II-III. Образцы крови будут собираться за день до операции и в послеоперационный день 1, 2, 3 и 10. Образцы будут подготовлены для проточного цитометрического анализа, биобанкинга, криоконсервации и геномного профилирования цельной крови.

Профилирование экспрессии генов цельной крови будет выполнено и проанализировано для определения возможных транскрипционных изменений в генах, кодирующих иммунологические, воспалительные и окислительные факторы, связанные со стрессом, вызванные хирургическим вмешательством. Можно провести как количественное, так и качественное измерение этих генетических изменений (11). Для дальнейшего анализа будут выбраны наборы зондов, которые, как будет установлено, наиболее значительно дифференцированно выражены до и после операции. Для дальнейшего анализа будут выбраны гены, регуляция которых значительно нарушена и которые были описаны в предыдущих исследованиях в области воспаления, иммунологического и окислительного стресса. Примерами точных генов в иммунологии и воспалении могут быть гены, кодирующие TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ и HLA-G. Среди окислительных и антиоксидантных генов особое внимание будет уделяться FoxO3, TP53 и ATM, поскольку их инактивация связана с повышенным уровнем АФК. Активация ATOX1, DEFB122 и GBX8 связана с повышенным уровнем АФК и также будет выбрана для дальнейшего анализа (19-21).

Изменения в специфических воспалительных и иммуномодулирующих белках (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ и HLA-G), функциональной активности естественных киллеров (NK) и фракций и абсолютное количество специфических субпопуляций иммунных клеток (CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+/CD4+CD25+CD127/dim регуляторные Т-клетки, CD4+HLA-G+ регуляторные Т-клетки, миелоидные супрессорные клетки и субпопуляции NK ) будут определены. Результаты анализа генетической транскрипции и анализа изменений воспалительных и иммуномодулирующих белков будут сравниваться, чтобы дать полное представление о SSR и влиянии хирургического вмешательства на иммунологические, окислительные и воспалительные факторы, чтобы оценить потенциальный канцерогенный эффект. эффект оперативного вмешательства, сроки и методы оптимального вмешательства в этот повреждающий процесс.

Образцы опухолей от 30 зарегистрированных пациентов будут проанализированы на уровень инвазии иммунологических клеток. Результаты будут сопоставлены с результатами профилирования экспрессии генов и анализа воспалительных и иммуномодулирующих белков, определенных в образцах цельной крови до операции. Будет проведена иммуногистохимия и оценена воспалительная инвазия опухоли в соответствии с методами Клинтрупа (12) и иммуноскорой (13). Эти методы основаны на системе подсчета баллов, определяющей самую глубокую точку инвазии воспалительных клеток, выявленную на предметных стеклах с гематоксилином и эозином.

Методы

Профилирование экспрессии генов цельной крови:

Образцы крови будут собраны в пробирки для генов PAX и отправлены на анализ в университетскую больницу Оденсе, отделение клинической генетики. Суммарная РНК будет извлечена с использованием набора Paxgene Blood RNA (Qiagen, Франклин-Лейкс, Нью-Джерси, США), а качество РНК будет проверено с использованием биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies, Пало-Альто, Калифорния). Набор для амплификации РНК Message-AmpTM III (Ambion, Остин, Техас) будет использоваться для преобразования тотальной РНК в меченую биотином аРНК. Меченая аРНК будет гибридизирована с чипами Affymetrix HGU133 Plus 2.0. Предварительная обработка данных будет выполняться в среде R с использованием надежной меры средней экспрессии для нескольких массивов (rma) для выполнения фоновой коррекции, нормализации и расчета индекса экспрессии для всех микрочипов. Дальнейший высокоуровневый анализ будет включать расширенные методы для многомерных данных, включая контролируемые и неконтролируемые методы. Будут рассчитаны кратные изменения, и будет использоваться анализ значимости микрочипа (SAM) и t-критерий для идентификации дифференциально экспрессируемых генов, образцов и коррекции для проверки множественных гипотез с использованием метода FDR. Анализ путей будет применяться для выявления биологических механизмов, активируемых хирургическими манипуляциями, с использованием анализа обогащения набора генов (GSEA, Broad Institute).

Оценка воспалительных и иммунологических маркеров:

Когда все образцы будут собраны, часть биобанков плазмы и сыворотки будет использоваться для измерения концентраций TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ и HLA-G с помощью ELISA на приборе BEP2000 ELISA (Siemens Healthcare, Эрланген, Германия) в больницах Роскилле, отделение Клиническая биохимия, где они имеют большой опыт в этих мерах.

Анализ субпопуляций лекоцитов:

Многоцветное иммунофенотипирование субпопуляций лейкоцитов проводят в течение 1-2 часов после забора крови. Анализ будет проводиться с использованием инструментов BD FACS Canto II (BD Biosciences, Нью-Джерси, США). Этот прибор анализирует восемь цветов/маркеров на пробирку. С помощью панелей специфических маркеров будут идентифицированы CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+/CD4+CD25+CD127/dim регуляторные Т-клетки, CD4+HLA-G+ регуляторные Т-клетки, супрессорные клетки миелоидного происхождения и подмножества NK. Результаты будут проанализированы в соответствии с воспалительной и иммунологической регуляцией вверх или вниз в период от дня до операции и до 10 дней после нее.

Иммуногистохимический анализ образцов опухоли:

Иммуногистохимия будет выполнена, когда все образцы будут собраны. Будет проанализирована глубина инвазии и количество клеток, экспрессирующих CD4, CD8, CD45RO и GZMB. Анализ будет проводиться по методу Клинтрупа, который представляет собой метод оценки в диапазоне от 0 до 3. Оценка 0 указывает на отсутствие увеличения воспалительных клеток в самой глубокой точке инвазивного края опухоли; 1 указывает на легкое и пятнистое увеличение; 2 указывает на выраженную воспалительную реакцию, а 3 обозначает ярко выраженный чашеобразный воспалительный инфильтрат по краю инвазии с частым разрушением островков раковых клеток. Эти оценки затем классифицируются как низкие (0 и 1) и высокие (2 и 3) оценки.

NK-клетки После выделения и криоконсервации РВМС функциональную активность NK-клеток определяют in vitro путем воздействия на них меченных хромом NK-чувствительных клеток-мишеней. Активность NK-клеток количественно определяют в этом анализе путем измерения хрома, высвобождаемого из мишеней, лизированных NK-клетками.