Immunologisk og oksidativ stressrespons i forhold til abdominal kreftkirurgi (IMOX)

Bakgrunn

Den perioperative perioden er relativt kort, men svært kritisk for kreftrelatert overlevelse. Den kirurgiske prosedyren resulterer i frigjøring av tumorceller lokalt og i blodet, og induksjon av en kirurgisk stressrespons (SSR). Dette fører til lammelse av immunsystemet, redusert clearance av kreftceller og optimale forhold for kreftceller til å vokse og metastasere(1).

Kolorektal kreft (CRC) er den tredje vanligste årsaken til kreft i Danmark. I 2013 ble 4196 danske pasienter diagnostisert med CRC(2), og dagens standardbehandling inkluderer en tumorreseksjon. Men selv etter en forventet kurativ kirurgisk tumorreseksjon vil 25-30 % få tilbakefall innen 5 år etter primærprosedyren.

For å forbedre resultatet etter operasjon for kreft, er det avgjørende å forstå, i detaljer, hvordan SSR påvirker immunresponsen og hvordan SSR påvirker kreftcellenes evne til å vokse og metastasere. Ved å utføre ekspresjonsprofilering av over 40.000 gener i fullblod før og etter operasjonen, vil vi få en genetisk signatur av gener fra sirkulerende immunceller, inkludert granulocytter, monocytter, B- og T-celler, dendrittiske celler og blodplater, som vil gjøre oss i stand til å se nøyaktig innvirkning kirurgi har på gentranskripsjon av disse immunologiske faktorene. Ved å bruke denne informasjonen kan perioperative intervensjoner utføres for å optimalisere den immunologiske responsen i den perioperative perioden, noe som fører til redusert risiko for tilbakefall av kreft og følgelig forbedret overlevelse (3).

Kirurgisk stressrespons (SSR) Det er velkjent at en kirurgisk prosedyre induserer en forstyrrelse av den immunologiske og inflammatoriske balansen, og forårsaker en systemisk inflammatorisk respons (4), immunsuppresjon (4,5) og overskytende reaktive oksygenarter (ROS) (6 ,7). Systemisk inflammasjon fremmer tumorvekst (8), og hos pasienter som har gjennomgått potensielt kurativ reseksjon for tykktarmskreft, predikerer tilstedeværelsen av en systemisk inflammatorisk respons et dårlig utfall (3). Lammelsen av immunsystemet inkluderer redusert aktivitet av NK-celler og makrofager, som begge under normale omstendigheter beskytter mot metastaser ved å eliminere disseminerende tumorceller. Overdreven ROS forårsaker DNA-skade, nedbrytning av ekstracellulær matrise og eliminering av celle-celleadhesjoner (5,6,7). På denne måten fremmer kirurgi optimale forhold for kreftceller til å vokse og metastasere i den postoperative fasen. Nyere forskning viser at immunceller og deres invasjon av primærtumoren korrelerer med pasientens prognose, noe som igjen antyder at immunresponsen er viktig for hemming av kreftvekst(9,10). Detaljert informasjon om genetiske endringer i ulike faktorer av immunresponsen på grunn av kirurgi er fortsatt uklar.

Studiedesign Prosjektet består av en klinisk prospektiv eksplorativ studie inkludert 30 pasienter som gjennomgår elektiv hemi-kolektomi på grunn av tykktarmskreft UICC stadion II-III. Blodprøver vil bli tatt dagen før operasjonen, og på postoperative dag 1, 2, 3 og 10. Det vil bli utarbeidet prøver for flowcytometrisk analyse, biobanking, kryokonservering og fullblods genomisk profilering.

Fullblodsgenekspresjonsprofilering vil bli utført og analysert for å bestemme mulige transkripsjonelle endringer i gener som koder for immunologiske, inflammatoriske og oksidativt stressrelaterte faktorer forårsaket av kirurgi. Det er mulig å foreta både en kvantitativ og kvalitativ måling av disse genetiske endringene (11). Probesettene som er funnet å være mest signifikant differensielt uttrykt før og etter operasjonen vil bli valgt for videre analyse. Gener som er betydelig deregulert og som er beskrevet i tidligere studier, innen feltet inflammasjon, immunologisk og oksidativt stress, vil bli valgt for videre analyse. Eksempler på eksakte gener innen immunologi og inflammasjon vil være gener som koder for TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ og HLA-G. Innen oksidative og antioksidative gener vil det legges spesiell vekt på FoxO3, TP53 og ATM da inaktivering av disse er assosiert med økte nivåer av ROS. Oppregulering av ATOX1, DEFB122 og GBX8 er assosiert med økte nivåer av ROS, og vil også bli valgt for videre analyse (19-21).

Endringer i spesifikke inflammatoriske og immunmodulerende proteiner (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ og HLA-G), den funksjonelle aktiviteten til naturlige drepeceller (NK) og fraksjonene og absolutt antall spesifikke underpopulasjoner av immunceller (CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim regulatoriske T-celler, CD4+HLA-G+ regulatoriske T-celler, myeloid-avledede suppressorceller og NK-undergrupper ) vil bli identifisert. Resultater fra genetisk transkripsjonsanalyse og analyse av endringer i inflammatoriske og immunmodulerende proteiner, vil bli sammenlignet for å gi en full oversikt over SSR, og effekten av kirurgi på immunologiske, oksidative og inflammatoriske faktorer, for å evaluere potensiell kreftfremkallende effekt. effekt av kirurgi, og tider og metoder for optimal intervensjon i denne skadelige prosessen.

Tumorprøver fra de 30 registrerte pasientene vil bli analysert for nivået av invasjon av immunologiske celler. Resultatene vil bli korrelert til resultatene fra genekspresjonsprofilering og analyse av inflammatoriske og immunmodulerende proteiner bestemt i fullblodsprøver før operasjon. Immunhistokjemi vil bli utført og inflammatorisk invasjon av svulsten vil bli evaluert i henhold til Klintrups metoder (12) og immunscore (13). Disse metodene er basert på et skåringssystem som definerer det dypeste punktet for invasjon av inflammatoriske celler identifisert fra hematoksylin- og eosinglass.

Metoder

Fullblodsgenekspresjonsprofilering:

Blodprøver vil bli tatt i PAX-genrør og sendt til analyse ved Odense Universitetssykehus, Avd. for klinisk genetikk. Totalt RNA vil bli ekstrahert ved hjelp av Paxgene Blood RNA-settet (Qiagen, Franklin Lakes, NJ, USA) og kvaliteten på RNA vil bli testet med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Message-AmpTM III RNA-amplifikasjonssettet (Ambion, Austin, TX) vil bli brukt til å konvertere totalt RNA til biotin-merket aRNA. Merket aRNA vil bli hybridisert til Affymetrix HGU133 Plus 2.0-brikker. Dataforbehandling vil bli gjort i R-miljø ved å bruke robust multi-array gjennomsnittlig uttrykksmål (rma) for å utføre bakgrunnskorreksjon, normalisering og ekspresjonsindeksberegning av alle mikroarrayer. Ytterligere høynivåanalyser vil inkludere avanserte metoder for høydimensjonale data inkludert overvåkede og uovervåkede metoder. Foldeendringer vil bli beregnet og signifikansanalyse av Microarray (SAM) og t-test vil bli brukt for å identifisere differensielt uttrykte gener, prøver og korreksjon for multiple hypotesetesting vil bli utført ved hjelp av FDR-metoden. Baneanalyse vil bli brukt for å identifisere de biologiske mekanismene som aktiveres av den kirurgiske manipulasjonen, ved hjelp av Gene Set Enrichment Analysis (GSEA, Broad Institute).

Vurdering av inflammatoriske og immunologiske markører:

Når alle prøver er samlet, vil en del av biobanket plasma og serum brukes til måling av konsentrasjoner av TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ og HLA-G ved ELISA-er på et BEP2000 ELISA-instrument (Siemens Healthcare, Erlangen, Tyskland) ved Roskilde sykehus, avd. Klinisk biokjemi, hvor de har mye erfaring med disse tiltakene.

Analyse av lekocyttsubpopulasjoner:

Flerfarget immunfenotyping av leukocyttsubpopulasjoner vil bli utført innen 1-2 timer etter at blodprøver er tatt. Analyse vil bli gjort ved bruk av BD FACS Canto II-instrumenter (BD Biosciences, New Jersey, USA). Dette instrumentet analyserer åtte farger/markører per rør. Ved bruk av spesifikke markørpaneler vil CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim regulatoriske T-celler, CD4+HLA-G+ regulatoriske T-celler, myeloid-avledede suppressorceller og NK-undergrupper identifiseres. Resultatene vil bli analysert etter inflammatorisk og immunologisk opp- eller nedregulering i perioden fra dagen før operasjonen og inntil 10 dager etter.

Immunhistokjemisk analyse av tumorprøver:

Immunhistokjemi vil bli utført når alle prøver er samlet. Invasjonsdybder og antall celler som uttrykker CD4, CD8, CD45RO og GZMB vil bli analysert. Analysen vil bli utført etter Klintrups metoder, som er en skåringsmetode fra 0-3. En skåre på 0 indikerer ingen økning i de inflammatoriske cellene på det dypeste punktet av svulstens invasive margin; 1 indikerer en mild og ujevn økning; 2 indikerer en fremtredende inflammatorisk reaksjon, og 3 angir et florid kopplignende inflammatorisk infiltrat ved den invasive kanten med hyppig ødeleggelse av kreftcelleøyer. Disse poengsummene blir deretter klassifisert som lav (0 og 1) og høy (2 og 3) karakter.

NK-celler Etter isolering av kryokonservering av PBMC-er, bestemmes den funksjonelle aktiviteten til NK-celler in vitro ved å eksponere dem for krommerkede NK-sensitive målceller. NK-celleaktivitet kvantifiseres i denne analysen ved måling av krom frigjort fra NK-cellelyserte mål.