Immunologiczna i oksydacyjna reakcja na stres w związku z operacją raka jamy brzusznej (IMOX)

Tło

Okres okołooperacyjny jest stosunkowo krótki, ale bardzo krytyczny dla przeżycia związanego z chorobą nowotworową. Zabieg chirurgiczny powoduje miejscowe i we krwi uwolnienie komórek nowotworowych oraz indukcję chirurgicznej odpowiedzi stresowej (SSR). Prowadzi to do paraliżu układu odpornościowego, zmniejszonego klirensu komórek nowotworowych i optymalnych warunków do wzrostu komórek nowotworowych i tworzenia przerzutów(1).

Rak jelita grubego (CRC) jest trzecią najczęstszą przyczyną raka w Danii. W 2013 r. u 4196 duńskich pacjentów zdiagnozowano CRC(2), a obecny standard leczenia obejmuje resekcję guza. Jednak nawet po oczekiwanej radykalnej chirurgicznej resekcji guza u 25-30% wystąpi nawrót w ciągu 5 lat po pierwotnym zabiegu.

Aby poprawić wyniki po operacji raka, kluczowe jest szczegółowe zrozumienie, w jaki sposób SSR wpływa na odpowiedź immunologiczną i jak SSR wpływa na zdolność komórek nowotworowych do wzrostu i tworzenia przerzutów. Wykonując profilowanie ekspresji ponad 40 000 genów w krwi pełnej przed i po operacji, uzyskamy genetyczną sygnaturę genów krążących komórek odpornościowych, w tym granulocytów, monocytów, limfocytów B i T, komórek dendrytycznych i płytek krwi, co umożliwi nam zobacz dokładny wpływ chirurgii na transkrypcję genów tych czynników immunologicznych. Wykorzystując te informacje, można przeprowadzić interwencje okołooperacyjne w celu optymalizacji odpowiedzi immunologicznej w okresie okołooperacyjnym, co prowadzi do zmniejszenia ryzyka nawrotu choroby nowotworowej i w konsekwencji do poprawy przeżycia (3).

Reakcja na stres chirurgiczny (SSR) Powszechnie wiadomo, że zabieg chirurgiczny wywołuje zaburzenie równowagi immunologicznej i zapalnej, powodując ogólnoustrojową odpowiedź zapalną (4), supresję immunologiczną (4,5) i nadmiar reaktywnych form tlenu (ROS) (6 ,7). Ogólnoustrojowe zapalenie sprzyja wzrostowi guza (8), a u pacjentów, którzy przeszli potencjalnie leczniczą resekcję z powodu raka jelita grubego, obecność ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej przewiduje złe wyniki (3). Porażenie układu odpornościowego obejmuje zmniejszoną aktywność komórek NK i makrofagów, które w normalnych warunkach chronią przed przerzutami poprzez eliminację rozprzestrzeniających się komórek nowotworowych. Nadmiar RFT powoduje uszkodzenie DNA, rozpad macierzy pozakomórkowej i eliminację adhezji komórka-komórka (5,6,7). W ten sposób zabieg chirurgiczny stwarza optymalne warunki do wzrostu komórek nowotworowych i tworzenia przerzutów w fazie pooperacyjnej. Ostatnie badania pokazują, że komórki układu odpornościowego i ich inwazja guza pierwotnego koreluje z rokowaniem pacjenta, ponownie sugerując, że odpowiedź immunologiczna jest ważna dla hamowania wzrostu nowotworu(9,10). Szczegółowe informacje na temat zmian genetycznych w różnych czynnikach odpowiedzi immunologicznej w wyniku operacji pozostają niejasne.

Projekt badania Projekt składa się z prospektywnego klinicznego badania eksploracyjnego obejmującego 30 pacjentów poddawanych planowej hemikolektomii z powodu raka okrężnicy w stadium UICC II-III. Krew zostanie pobrana w dniu poprzedzającym operację oraz w 1, 2, 3 i 10 dniu po operacji. Próbki zostaną przygotowane do analizy metodą cytometrii przepływowej, biobankowania, kriokonserwacji i profilowania genomowego pełnej krwi.

Profilowanie ekspresji genów pełnej krwi zostanie przeprowadzone i przeanalizowane w celu określenia możliwych zmian transkrypcyjnych w genach kodujących czynniki immunologiczne, zapalne i związane ze stresem oksydacyjnym wywołanym zabiegiem chirurgicznym. Możliwe jest dokonanie zarówno ilościowego, jak i jakościowego pomiaru tych zmian genetycznych (11). Zestawy sond, które okazały się najbardziej zróżnicowane pod względem ekspresji przed i po operacji, zostaną wybrane do dalszej analizy. Do dalszych analiz zostaną wybrane geny, które są znacznie rozregulowane i zostały opisane we wcześniejszych badaniach w zakresie zapalenia, stresu immunologicznego i oksydacyjnego. Przykładami dokładnych genów w zakresie immunologii i zapalenia będą geny kodujące TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ i HLA-G. W ramach genów oksydacyjnych i antyoksydacyjnych szczególny nacisk zostanie położony na FoxO3, TP53 i ATM, ponieważ ich inaktywacja wiąże się ze zwiększonym poziomem ROS. Regulacja w górę ATOX1, DEFB122 i GBX8 jest związana ze zwiększonymi poziomami ROS i zostanie również wybrana do dalszej analizy (19-21).

Zmiany w określonych białkach zapalnych i immunomodulujących (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ i HLA-G), czynnościowej aktywności komórek naturalnych zabójców (NK) i frakcji i liczby bezwzględne określonych subpopulacji komórek odpornościowych (CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127/dim regulatorowe limfocyty T, CD4+HLA-G+ regulatorowe limfocyty T, komórki supresorowe pochodzenia szpikowego i podgrupy NK ) zostanie zidentyfikowany. Wyniki analizy transkrypcji genetycznej i analizy zmian w białkach zapalnych i immunomodulujących zostaną porównane w celu uzyskania pełnego przeglądu SSR oraz wpływu operacji na czynniki immunologiczne, oksydacyjne i zapalne, w celu oceny potencjalnego działania rakotwórczego efekt operacji oraz czasy i metody optymalnej interwencji w ten niszczący proces.

Próbki guzów od 30 włączonych pacjentów zostaną przeanalizowane pod kątem poziomu inwazji komórek immunologicznych. Wyniki zostaną skorelowane z wynikami profilowania ekspresji genów i analizy białek zapalnych i immunomodulujących określonych w próbkach pełnej krwi przed operacją. Przeprowadzona zostanie immunohistochemia i ocena inwazji zapalnej guza zgodnie z metodami Klintrupa (12) i immunoscore (13). Metody te opierają się na systemie punktacji określającym najgłębszy punkt inwazji komórek zapalnych zidentyfikowany na preparatach hematoksyliny i eozyny.

Metody

Profilowanie ekspresji genów krwi pełnej:

Próbki krwi zostaną pobrane do probówek z genem PAX i przesłane do analizy w Szpitalu Uniwersyteckim w Odense, Dept. of Clinical Genetics. Całkowity RNA zostanie wyekstrahowany przy użyciu zestawu Paxgene Blood RNA (Qiagen, Franklin Lakes, NJ, USA), a jakość RNA zostanie zbadana przy użyciu Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Zestaw do amplifikacji RNA Message-AmpTM III (Ambion, Austin, TX) zostanie użyty do przekształcenia całkowitego RNA w znakowany biotyną aRNA. Wyznakowany aRNA zostanie zhybrydyzowany z chipami Affymetrix HGU133 Plus 2.0. Wstępne przetwarzanie danych zostanie przeprowadzone w środowisku R przy użyciu solidnej wielomacierzowej miary średniej ekspresji (rma) w celu przeprowadzenia korekcji tła, normalizacji i obliczenia indeksu ekspresji dla wszystkich mikromacierzy. Dalsza analiza wysokiego poziomu będzie obejmować zaawansowane metody dla danych wielowymiarowych, w tym metody nadzorowane i nienadzorowane. Zostaną obliczone zmiany krotności, a analiza istotności mikromacierzy (SAM) i test t zostaną wykorzystane do identyfikacji genów o różnej ekspresji, próbki i poprawka do testowania wielu hipotez zostaną przeprowadzone przy użyciu metody FDR. Analiza ścieżek zostanie zastosowana do zidentyfikowania mechanizmów biologicznych aktywowanych przez manipulację chirurgiczną, przy użyciu analizy wzbogacania zbioru genów (GSEA, Broad Institute).

Ocena markerów zapalnych i immunologicznych:

Po zebraniu wszystkich próbek część osocza i surowicy z banku biologicznego zostanie wykorzystana do pomiaru stężeń TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ i HLA-G przez Testy ELISA na aparacie BEP2000 ELISA (Siemens Healthcare, Erlangen, Niemcy) w Roskilde Hospitals, Dept.of Biochemii Klinicznej, gdzie mają duże doświadczenie z tymi środkami.

Analiza subpopulacji lekocytów:

Wielokolorowe immunofenotypowanie subpopulacji leukocytów zostanie przeprowadzone w ciągu 1-2 godzin po pobraniu próbek krwi. Analiza zostanie przeprowadzona przy użyciu instrumentów BD FACS Canto II (BD Biosciences, New Jersey, USA). To urządzenie analizuje osiem kolorów/markerów na probówkę. Dzięki zastosowaniu specyficznych paneli markerów CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+/CD4+CD25+CD127/dim regulatorowe limfocyty T, CD4+HLA-G+ regulatorowe limfocyty T, komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego i podzbiory NK zostaną zidentyfikowane. Wyniki będą analizowane pod kątem regulacji zapalnej i immunologicznej w górę lub w dół w okresie od dnia poprzedzającego operację do 10 dni po zabiegu.

Analiza immunohistochemiczna próbek guza:

Immunohistochemia zostanie przeprowadzona po pobraniu wszystkich próbek. Przeanalizowane zostaną głębokość inwazji i liczba komórek wykazujących ekspresję CD4, CD8, CD45RO i GZMB. Analiza zostanie przeprowadzona zgodnie z metodą Klintrupa, czyli metodą punktacji od 0 do 3. Wynik 0 wskazuje na brak wzrostu komórek zapalnych w najgłębszym punkcie inwazyjnego marginesu guza; 1 wskazuje na łagodny i niejednolity wzrost; 2 wskazuje na wyraźną reakcję zapalną, a 3 oznacza florystyczny naciek zapalny przypominający miseczkę na krawędzi inwazyjnej z częstym niszczeniem wysp komórek nowotworowych. Wyniki te są następnie klasyfikowane jako niskie (0 i 1) i wysokie (2 i 3).

Komórki NK Po izolacji i kriokonserwacji PBMC aktywność funkcjonalną komórek NK określa się in vitro przez wystawienie ich na działanie docelowych komórek NK wrażliwych na NK znakowanych chromem. Aktywność komórek NK określa się ilościowo w tym teście przez pomiar chromu uwalnianego z komórek docelowych poddanych lizie komórek NK.