Immunologinen ja oksidatiivinen stressivaste suhteessa vatsasyöpäkirurgiaan (IMOX)

Tausta

Perioperatiivinen ajanjakso on suhteellisen lyhyt, mutta erittäin kriittinen syöpään liittyvän eloonjäämisen kannalta. Kirurginen toimenpide johtaa kasvainsolujen vapautumiseen paikallisesti ja veressä sekä kirurgisen stressireaktion (SSR) indusoitumiseen. Tämä johtaa immuunijärjestelmän halvaantumiseen, syöpäsolujen puhdistuman vähenemiseen ja optimaalisiin olosuhteisiin syöpäsolujen kasvulle ja etäpesäkkeille (1).

Kolorektaalisyöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syövän aiheuttaja Tanskassa. Vuonna 2013 4 196 tanskalaisella potilaalla diagnosoitiin CRC(2), ja nykyiseen hoitotasoon kuuluu kasvaimen resektio. Kuitenkin jopa odotettavissa olevan parantavan kirurgisen kasvaimen resektion jälkeen 25-30 %:lla uusiutuminen tapahtuu 5 vuoden sisällä ensisijaisesta toimenpiteestä.

Syövän leikkauksen jälkeisen tuloksen parantamiseksi on ratkaisevan tärkeää ymmärtää yksityiskohtaisesti, kuinka SSR vaikuttaa immuunivasteeseen ja kuinka SSR vaikuttaa syöpäsolujen kykyyn kasvaa ja muodostaa metastasoituja. Suorittamalla ilmentymisprofiloinnin yli 40 000 geenille kokoveressä ennen leikkausta ja sen jälkeen saamme geenien geneettisen allekirjoituksen kiertävistä immuunisoluista, mukaan lukien granulosyytit, monosyytit, B- ja T-solut, dendriittisolut ja verihiutaleet, mikä mahdollistaa Katso tarkka vaikutus leikkauksella näiden immunologisten tekijöiden geenitranskriptioon. Näitä tietoja käyttämällä voidaan suorittaa perioperatiivisia interventioita immunologisen vasteen optimoimiseksi perioperatiivisella jaksolla, mikä vähentää syövän uusiutumisen riskiä ja siten parantaa eloonjäämistä (3).

Kirurginen stressivaste (SSR) On hyvin tunnettua, että kirurginen toimenpide aiheuttaa häiriöitä immunologisessa ja tulehdustasapainossa aiheuttaen systeemisen tulehdusvasteen (4), immuunivasteen (4,5) ja ylimääräisen reaktiivisen happilajin (ROS) (6) ,7). Systeeminen tulehdus edistää kasvaimen kasvua (8), ja potilailla, joille on tehty potentiaalisesti parantava paksusuolensyövän resektio, systeemisen tulehdusvasteen esiintyminen ennustaa huonon lopputuloksen (3). Immuunijärjestelmän halvaantumiseen sisältyy NK-solujen ja makrofagien vähentynyt aktiivisuus, jotka molemmat suojaavat normaaleissa olosuhteissa etäpesäkkeiltä eliminoimalla leviäviä kasvainsoluja. Liiallinen ROS aiheuttaa DNA-vaurioita, solunulkoisen matriisin hajoamista ja solu-soluadheesioiden eliminaatiota (5,6,7). Tällä tavalla leikkaus edistää optimaaliset olosuhteet syöpäsolujen kasvulle ja etäpesäkkeiden muodostumiselle leikkauksen jälkeisessä vaiheessa. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että immuunisolut ja niiden tunkeutuminen primaariseen kasvaimeen korreloivat potilaan ennusteen kanssa, mikä viittaa jälleen siihen, että immuunivaste on tärkeä syövän kasvun estämisessä (9,10). Leikkauksen aiheuttamien immuunivasteen eri tekijöiden geneettisistä muutoksista on edelleen epäselvää.

Tutkimuksen suunnittelu Projekti koostuu kliinisestä prospektiivisesta eksploratiivisesta tutkimuksesta, johon kuuluu 30 potilasta, joille tehdään elektiivinen hemikolektomia paksusuolensyövän vuoksi. UICC-stadion II-III. Verinäytteet otetaan leikkausta edeltävänä päivänä ja leikkauksen jälkeisinä päivinä 1, 2, 3 ja 10. Näytteet valmistetaan virtaussytometristä analyysiä, biopankkia, kylmäsäilytystä ja kokoveren genomiprofiilia varten.

Kokoveren geenien ilmentymisen profilointi suoritetaan ja analysoidaan mahdollisten transkriptionaalisten muutosten määrittämiseksi geeneissä, jotka koodaavat leikkauksen aiheuttamia immunologisia, tulehduksellisia ja oksidatiivisia stressiin liittyviä tekijöitä. Näistä geneettisistä muutoksista on mahdollista tehdä sekä kvantitatiivinen että laadullinen mittaus (11). Lisäanalyysiä varten valitaan koetinsarjat, joiden todetaan olevan merkittävin erilaisuus ennen ja jälkeen leikkausta. Geenit, jotka ovat merkittävästi dereguloituja ja joita on kuvattu aiemmissa tutkimuksissa tulehduksen, immunologisen ja oksidatiivisen stressin alalla, valitaan jatkoanalyysiin. Esimerkkejä tarkoista geeneistä immunologiassa ja tulehduksessa ovat geenit, jotka koodaavat TNFa:ta, IL-1b:tä, IL-2:ta, IL-6:ta, IL-10:tä, VEGF:ää, TGFp:aa ja HLA-G:tä. Oksidatiivisissa ja antioksidatiivisissa geeneissä erityistä huomiota kiinnitetään FoxO3:een, TP53:een ja ATM:ään, koska näiden inaktivoituminen liittyy lisääntyneisiin ROS-tasoihin. ATOX1:n, DEFB122:n ja GBX8:n lisääntynyt säätely liittyy lisääntyneisiin ROS-tasoihin, ja se valitaan myös lisäanalyysiin (19-21).

Muutokset spesifissä tulehdusta ja immuunijärjestelmää moduloivissa proteiineissa (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ ja HLA-G), luonnollisten tappajasolujen (NK) toiminnallisessa aktiivisuudessa ja fraktioissa ja immuunisolujen spesifisten alapopulaatioiden absoluuttiset lukumäärät (CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim säätelevät T-solut, CD4+HLA-G+-säätely-T-solut, myeloidiperäiset suppressorisolut ja NK-alajoukot ) tunnistetaan. Geneettisen transkriptioanalyysin ja tulehduksellisten ja immuunijärjestelmää moduloivien proteiinien muutosten analyysin tuloksia verrataan, jotta saadaan täydellinen yleiskuva SSR:stä ja leikkauksen vaikutuksesta immunologisiin, oksidatiivisiin ja tulehdustekijöihin, jotta voidaan arvioida mahdollisia syöpää aiheuttavia vaikutuksia. leikkauksen vaikutus ja ajat ja menetelmät optimaaliselle puuttumiselle tähän vahingolliseen prosessiin.

Tutkimukseen osallistuneiden 30 potilaan kasvainnäytteet analysoidaan immunologisten solujen invaasion tasoa varten. Tulokset korreloidaan tuloksiin, jotka on saatu geeniekspression profiloinnista ja tulehdus- ja immuunijärjestelmää moduloivien proteiinien analysoinnista, jotka on määritetty kokoverinäytteistä ennen leikkausta. Immunohistokemia suoritetaan ja kasvaimen tulehduksellinen invaasiota arvioidaan Klintrupin menetelmien (12) ja immunoscore-arvon (13) mukaisesti. Nämä menetelmät perustuvat pisteytysjärjestelmään, joka määrittää hematoksyliini- ja eosiinilevyistä tunnistettujen tulehdussolujen tunkeutumisen syvimmän kohdan.

menetelmät

Kokoveren geeniekspression profilointi:

Verinäytteet kerätään PAX-geeniputkiin ja lähetetään analysoitavaksi Odensen yliopistolliseen sairaalaan, Dept. of Clinical Genetics. Kokonais-RNA uutetaan käyttämällä Paxgene Blood RNA -kittiä (Qiagen, Franklin Lakes, NJ, USA) ja RNA:n laatu testataan käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer -laitetta (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Message-AmpTM III RNA:n monistussarjaa (Ambion, Austin, TX) käytetään muuntamaan kokonais-RNA biotiinileimatuksi aRNA:ksi. Leimattu aRNA hybridisoidaan Affymetrix HGU133 Plus 2.0 -siruihin. Tietojen esikäsittely suoritetaan R-ympäristössä käyttämällä vankkaa monen taulukon keskimääräistä ilmentymismittaria (rma) taustakorjauksen, normalisoinnin ja ekspressioindeksin laskemiseksi kaikille mikromatriisille. Korkean tason lisäanalyysi sisältää kehittyneitä menetelmiä korkean ulottuvuuden tiedoille, mukaan lukien valvotut ja valvomattomat menetelmät. Taittomuutokset lasketaan ja Microarrayn (SAM) ja t-testin merkitsevyysanalyysiä käytetään tunnistamaan differentiaalisesti ilmentyneet geenit, näytteet ja korjaus useiden hypoteesien testaamiseen suoritetaan FDR-menetelmällä. Reittianalyysiä sovelletaan kirurgisen manipulaation aktivoimien biologisten mekanismien tunnistamiseen käyttämällä Gene Set Enrichment Analysis -analyysiä (GSEA, Broad Institute).

Tulehduksellisten ja immunologisten merkkiaineiden arviointi:

Kun kaikki näytteet on kerätty, osa biopankkiplasmasta ja seerumista käytetään TNFα-, IL-1b-, IL-2-, IL-6-, IL-10-, VEGF-, TGFp- ja HLA-G-pitoisuuksien mittaamiseen ELISA-testit BEP2000 ELISA-laitteella (Siemens Healthcare, Erlangen, Saksa) Roskilden sairaalassa, Dept.of Kliininen biokemia, jossa heillä on paljon kokemusta näistä toimenpiteistä.

Lekosyyttialapopulaatioiden analyysi:

Leukosyyttialapopulaatioiden monivärinen immunofenotyypitys suoritetaan 1-2 tunnin sisällä verinäytteiden ottamisen jälkeen. Analyysi tehdään käyttämällä BD FACS Canto II -laitteita (BD Biosciences, New Jersey, USA). Tämä laite analysoi kahdeksan väriä/merkkiä putkea kohti. Spesifisiä markkeripaneeleja käyttämällä CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+/CD4+CD25+CD127/dim säätelevät T-solut, CD4+HLA-G+-säätely-T-solut, myeloidista peräisin olevat suppressorisolut ja NK-alajoukot tunnistetaan. Tulokset analysoidaan tulehduksellisen ja immunologisen ylös- tai alaspäin säätelyn mukaan leikkausta edeltävänä päivänä ja 10 päivään sen jälkeen.

Kasvainnäytteiden immunohistokemiallinen analyysi:

Immunohistokemia suoritetaan, kun kaikki näytteet on kerätty. Invaasion syvyydet ja CD4:ää, CD8:aa, CD45RO:ta ja GZMB:tä ilmentävien solujen lukumäärä analysoidaan. Analyysi suoritetaan Klintrupin menetelmillä, joka on pisteytysmenetelmä, joka vaihtelee välillä 0-3. Pistemäärä 0 osoittaa, ettei tulehduksellisten solujen määrä kasvaa kasvainten invasiivisen reunan syvimmässä kohdassa; 1 osoittaa lievää ja hajanaista kasvua; 2 osoittaa näkyvää tulehdusreaktiota, ja 3 tarkoittaa vaaleaa kuppimaista tulehduksellista infiltraattia invasiivisessa reunassa, jossa syöpäsolusaarekkeet tuhoutuvat usein. Nämä pisteet luokitellaan sitten matalaksi (0 ja 1) ja korkeaksi (2 ja 3).

NK-solut PBMC-solujen kylmäsäilytyksen jälkeen eristämisen jälkeen NK-solujen toiminnallinen aktiivisuus määritetään in vitro altistamalla ne kromileimatuille NK-herkille kohdesoluille. NK-soluaktiivisuus kvantifioidaan tässä määrityksessä mittaamalla NK-solujen hajottamista kohteista vapautunut kromi.