与腹部癌手术相关的免疫学和氧化应激反应 (IMOX)

背景

围手术期相对较短，但对癌症相关的生存非常关键。 外科手术导致局部和血液中的肿瘤细胞释放，并诱导外科应激反应 (SSR)。 这会导致免疫系统瘫痪、癌细胞清除减少以及癌细胞生长和转移的最佳条件 (1)。

结直肠癌 (CRC) 是丹麦第三大常见癌症。 2013 年，4196 名丹麦患者被诊断出患有 CRC(2)，目前的护理标准包括肿瘤切除术。 然而，即使在预期的治愈性手术肿瘤切除后，仍有 25-30% 的患者会在初次手术后的 5 年内复发。

为了改善癌症手术后的结果，详细了解 SSR 如何影响免疫反应以及 SSR 如何影响癌细胞生长和转移的能力至关重要。 通过对手术前后全血中超过 40.000 个基因进行表达谱分析，我们将从循环免疫细胞（包括粒细胞、单核细胞、B 细胞和 T 细胞、树突细胞和血小板）中获得基因的遗传特征，这将使我们能够查看手术对这些免疫因子的基因转录的确切影响。 通过使用这些信息，可以进行围手术期干预以优化围手术期的免疫反应，从而降低癌症复发的风险，从而提高生存率 (3)。

外科应激反应 (SSR) 众所周知，外科手术会引起免疫和炎症平衡的紊乱，从而引起全身炎症反应 (4)、免疫抑制 (4,5) 和过量活性氧 (ROS) (6 ,7). 全身性炎症会促进肿瘤生长 (8)，而在接受了结直肠癌可能治愈性切除术的患者中，全身性炎症反应的存在预示着不良结果 (3)。 免疫系统的麻痹包括 NK 细胞和巨噬细胞的活性降低，这两种细胞在正常情况下都通过消除散布的肿瘤细胞来防止转移。 过多的 ROS 会导致 DNA 损伤、细胞外基质分解和细胞间粘附消除 (5,6,7)。 通过这种方式，手术促进了癌细胞在术后阶段生长和转移的最佳条件。 最近的研究表明，免疫细胞及其对原发性肿瘤的侵袭与患者的预后相关，再次表明免疫反应对于抑制癌症生长很重要 (9,10)。 由于手术导致的免疫反应的不同因素的遗传变化的详细信息仍不清楚。

研究设计 该项目包括一项临床前瞻性探索性研究，包括 30 名因结肠癌 UICC 体育场 II-III 而接受择期半结肠切除术的患者。 血液样本将在手术前一天和术后第 1、2、3 和 10 天采集。 样品将准备用于流式细胞术分析、生物银行、冷冻保存和全血基因组分析。

将进行全血基因表达谱分析，以确定编码由手术引起的免疫、炎症和氧化应激相关因素的基因可能发生的转录变化。 可以对这些遗传变化进行定量和定性测量 (11)。将选择手术前后差异表达最显着的探针组进行进一步分析。 将选择在炎症、免疫学和氧化应激领域内显着解除管制并已在先前研究中描述的基因进行进一步分析。 免疫学和炎症中确切基因的例子是编码 TNFα、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、TGFβ 和 HLA-G 的基因。 在氧化和抗氧化基因中，将特别强调 FoxO3、TP53 和 ATM，因为这些基因的失活与 ROS 水平升高有关。 ATOX1、DEFB122 和 GBX8 的上调与 ROS 水平升高相关，也将被选择用于进一步分析 (19-21)。

特定炎症和免疫调节蛋白（TNFα、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、TGFβ 和 HLA-G）、自然杀伤 (NK) 细胞的功能活性及其组分的改变和特定免疫细胞亚群的绝对数量（CD3+CD4+、CD3+CD8+、FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim 调节性 T 细胞、CD4+HLA-G+ 调节性 T 细胞、髓源性抑制细胞和 NK 亚群) 将被识别。 将比较基因转录分析和炎症和免疫调节蛋白改变分析的结果，以全面了解 SSR，以及手术对免疫、氧化和炎症因子的影响，以评估潜在的致癌性手术的效果，以及在这个破坏过程中最佳干预的时间和方法。

将分析来自 30 名登记患者的肿瘤样本的免疫细胞侵袭水平。 结果将与手术前全血样本中确定的炎症和免疫调节蛋白的基因表达谱分析和分析结果相关联。 将进行免疫组织化学，并根据 Klintrup 的方法 (12) 和免疫评分 (13) 评估肿瘤的炎症侵袭。 这些方法基于一个评分系统，该评分系统定义了从苏木精和伊红载玻片中识别出的炎症细胞侵入的最深点。

方法

全血基因表达谱：

血液样本将收集在 PAX 基因管中，并送往欧登塞大学医院临床遗传学系进行分析。 总 RNA 将使用 Paxgene 血液 RNA 试剂盒（Qiagen，Franklin Lakes，NJ，USA）提取，RNA 的质量将使用 Agilent 2100 生物分析仪（Agilent Technologies，Palo Alto，CA）进行测试。 Message-AmpTM III RNA 扩增试剂盒（Ambion，Austin，TX）将用于将总 RNA 转化为生物素标记的 aRNA。 标记的 aRNA 将与 Affymetrix HGU133 Plus 2.0 芯片杂交。 数据预处理将在 R 环境中使用稳健的多阵列平均表达测量 (rma) 进行，以执行所有微阵列的背景校正、归一化和表达指数计算。 进一步的高级分析将包括针对高维数据的高级方法，包括监督和非监督方法。 将计算倍数变化，并使用微阵列显着性分析 (SAM) 和 t 检验来识别差异表达的基因、样本，并使用 FDR 方法对多个假设检验进行校正。 使用基因集富集分析（GSEA，Broad Institute），将应用通路分析来识别手术操作激活的生物学机制。

炎症和免疫标志物的评估：

当收集完所有样本后，部分生物库血浆和血清将用于通过以下方式测量 TNFα、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、TGFβ 和 HLA-G 的浓度在 Roskilde Hospitals, Dept.of 的 BEP2000 ELISA 仪器（Siemens Healthcare, Erlangen, Germany）上进行 ELISA 临床生物化学，他们在这些措施方面有很多经验。

白细胞亚群分析：

白细胞亚群的多色免疫分型将在抽取血样后 1-2 小时内进行。 将使用 BD FACS Canto II 仪器（BD Biosciences，新泽西，美国）进行分析。 该仪器分析每管八种颜色/标记。 通过使用特异性标记物组，CD3+CD4+、CD3+CD8+、FoxP3+/CD4+CD25+CD127/dim 调节性 T 细胞、CD4+HLA-G+ 调节性 T 细胞、骨髓来源的抑制细胞和 NK 亚群将被识别。 根据从手术前一天到手术后 10 天期间的炎症和免疫上调或下调来分析结果。

肿瘤标本的免疫组织化学分析：

收集完所有样本后将进行免疫组织化学。 将分析入侵深度和表达 CD4、CD8、CD45RO 和 GZMB 的细胞数量。 分析将根据 Klintrup 的方法进行，这是一种评分方法，范围为 0-3。 0分表示肿瘤浸润边缘最深处炎症细胞无增加； 1 表示轻微且不规则的增加； 2表示明显的炎症反应，3表示浸润边缘有大量杯状炎症浸润，癌细胞岛频繁破坏。 然后将这些分数分为低（0 和 1）和高（2 和 3）等级。

NK 细胞 PBMC 的冷冻保存分离后，通过将 NK 细胞暴露于铬标记的 NK 敏感靶细胞，在体外测定 NK 细胞的功能活性。 NK 细胞活性在此测定中通过测量从 NK 细胞裂解靶标释放的铬来量化。