Immunologisk og oxidativ stressrespons i relation til abdominal cancerkirurgi (IMOX)

Baggrund

Den perioperative periode er relativt kort, men yderst kritisk for kræftrelateret overlevelse. Den kirurgiske procedure resulterer i frigivelse af tumorceller lokalt og i blodet og induktion af et kirurgisk stressrespons (SSR). Dette fører til lammelse af immunsystemet, reduceret clearance af kræftceller og optimale betingelser for kræftcellers vækst og metastasering(1).

Kolorektal cancer (CRC) er den tredjehyppigste årsag til kræft i Danmark. I 2013 blev 4196 danske patienter diagnosticeret med CRC(2), og den nuværende standardbehandling omfatter en tumorresektion. Men selv efter en forventet kurativ kirurgisk tumorresektion vil 25-30 % have et tilbagefald inden for 5 år efter den primære procedure.

For at forbedre resultatet efter operation for cancer, er det afgørende at forstå i detaljer, hvordan SSR påvirker immunresponset, og hvordan SSR påvirker kræftcellernes evne til at vokse og metastasere. Ved at udføre ekspressionsprofilering af over 40.000 gener i fuldblod før og efter operationen, vil vi opnå en genetisk signatur af gener fra cirkulerende immunceller, herunder granulocytter, monocytter, B- og T-celler, dendritiske celler og blodplader, som vil gøre os i stand til at se den nøjagtige indvirkning kirurgi har på gentransskription af disse immunologiske faktorer. Ved at bruge denne information kan der udføres perioperative indgreb for at optimere det immunologiske respons i den perioperative periode, hvilket fører til reduceret risiko for kræfttilbagefald og dermed forbedret overlevelse (3).

Kirurgisk stressrespons (SSR) Det er velkendt, at et kirurgisk indgreb inducerer en forstyrrelse af den immunologiske og inflammatoriske balance, hvilket forårsager et systemisk inflammatorisk respons (4), immunundertrykkelse (4,5) og overskydende reaktive oxygenarter (ROS) (6 ,7). Systemisk inflammation fremmer tumorvækst (8), og hos patienter, der har gennemgået potentielt helbredende resektion for kolorektal cancer, forudsiger tilstedeværelsen af ​​et systemisk inflammatorisk respons et dårligt resultat (3). Lammelsen af ​​immunsystemet omfatter reduceret aktivitet af NK-celler og makrofager, som begge under normale omstændigheder beskytter mod metastaser ved at eliminere disseminerende tumorceller. Overdreven ROS forårsager DNA-skade, nedbrydning af ekstracellulær matrix og eliminering af celle-celle-adhæsioner (5,6,7). På denne måde fremmer kirurgi optimale betingelser for kræftcellers vækst og metastasering i den postoperative fase. Nyere forskning viser, at immunceller og deres invasion af den primære tumor korrelerer med patientens prognose, hvilket igen tyder på, at immunresponset er vigtigt for hæmning af cancervækst(9,10). Detaljerede oplysninger om genetiske ændringer i forskellige faktorer af immunresponset på grund af kirurgi forbliver uklare.

Studiedesign Projektet består af et klinisk prospektivt eksplorativt studie med 30 patienter, der gennemgår elektiv hemi-kolektomi på grund af tyktarmskræft UICC stadion II-III. Blodprøver vil blive indsamlet dagen før operationen og på postoperativ dag 1, 2, 3 og 10. Prøver vil blive forberedt til flowcytometrisk analyse, biobanking, kryokonservering og genomisk fuldblodsprofilering.

Genekspressionsprofilering i fuldblod vil blive udført og analyseret for at bestemme mulige transkriptionelle ændringer i gener, der koder for immunologiske, inflammatoriske og oxidative stress-relaterede faktorer forårsaget af kirurgi. Det er muligt at foretage både en kvantitativ såvel som en kvalitativ måling af disse genetiske ændringer (11). De probesæt, der viser sig at være mest signifikant differentielt udtrykt før og efter operation, vil blive udvalgt til yderligere analyse. Gener, der er væsentligt deregulerede og er blevet beskrevet i tidligere studier, inden for området inflammation, immunologisk og oxidativt stress, vil blive udvalgt til yderligere analyse. Eksempler på eksakte gener inden for immunologi og inflammation vil være gener, der koder for TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ og HLA-G. Inden for oxidative og antioxidative gener vil der blive lagt særlig vægt på FoxO3, TP53 og ATM, da inaktivering af disse er forbundet med øgede niveauer af ROS. Opregulering af ATOX1, DEFB122 og GBX8 er forbundet med øgede niveauer af ROS, og vil også blive valgt til yderligere analyse (19-21).

Ændringer i specifikke inflammatoriske og immunmodulerende proteiner (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ og HLA-G), den funktionelle aktivitet af naturlige dræberceller (NK) og fraktionerne og absolutte antal af specifikke underpopulationer af immunceller (CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+/CD4+CD25+CD127/dim regulatoriske T-celler, CD4+HLA-G+ regulatoriske T-celler, myeloid-afledte suppressorceller og NK-undergrupper ) vil blive identificeret. Resultater fra genetisk transkriptionsanalyse og analyse af ændringer i inflammatoriske og immunmodulerende proteiner, vil blive sammenlignet for at give et fuldt overblik over SSR, og effekten af ​​kirurgi på immunologiske, oxidative og inflammatoriske faktorer, for at evaluere den potentielle kræftfremkaldende faktor. virkningen af ​​kirurgi og tidspunkter og metoder til optimal intervention i denne skadelige proces.

Tumorprøver fra de 30 tilmeldte patienter vil blive analyseret for niveauet af invasion af immunologiske celler. Resultaterne vil blive korreleret til resultaterne fra genekspressionsprofilering og analyse af inflammatoriske og immunmodulerende proteiner bestemt i fuldblodsprøver før operation. Der vil blive udført immunhistokemi, og inflammatorisk invasion af tumoren vil blive vurderet efter Klintrups metoder (12) og immunscore (13). Disse metoder er baseret på et scoringssystem, der definerer det dybeste punkt for invasion af inflammatoriske celler identificeret fra hæmatoxylin og eosin-glas.

Metoder

Genekspressionsprofilering af fuldblod:

Blodprøver vil blive opsamlet i PAX-genrør og sendt til analyse på Odense Universitetshospital, Afd. for Klinisk Genetik. Total RNA vil blive ekstraheret ved hjælp af Paxgene Blood RNA kit (Qiagen, Franklin Lakes, NJ, USA), og kvaliteten af ​​RNA vil blive testet ved hjælp af Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Message-AmpTM III RNA-amplifikationskittet (Ambion, Austin, TX) vil blive brugt til at konvertere totalt RNA til biotin-mærket aRNA. Mærket aRNA vil blive hybridiseret til Affymetrix HGU133 Plus 2.0 chips. Dataforbehandling vil blive udført i R-miljø ved hjælp af robust multi-array gennemsnitsekspressionsmål (rma) til at udføre baggrundskorrektion, normalisering og ekspressionsindeksberegning af alle mikroarrays. Yderligere analyse på højt niveau vil omfatte avancerede metoder til højdimensionelle data, herunder overvågede og ikke-overvågede metoder. Foldeændringer vil blive beregnet, og signifikansanalyse af Microarray (SAM) og t-test vil blive brugt til at identificere differentielt udtrykte gener, prøver og korrektion til multiple hypotesetestning vil blive udført ved hjælp af FDR-metoden. Pathway-analyse vil blive anvendt til at identificere de biologiske mekanismer, der aktiveres af den kirurgiske manipulation, ved hjælp af Gene Set Enrichment Analysis (GSEA, Broad Institute).

Vurdering af inflammatoriske og immunologiske markører:

Når alle prøver er blevet indsamlet, vil en del af det biobankede plasma og serum blive brugt til måling af koncentrationer af TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ og HLA-G ved ELISA'er på et BEP2000 ELISA-instrument (Siemens Healthcare, Erlangen, Tyskland) på Roskilde Hospitaler, afd. Klinisk Biokemi, hvor de har stor erfaring med disse tiltag.

Analyse af lekocytunderpopulationer:

Multi-farve immunfænotypning af leukocyt sub-populationer vil blive udført inden for 1-2 timer efter blodprøver er blevet udtaget. Analyse vil blive udført ved brug af BD FACS Canto II-instrumenter (BD Biosciences, New Jersey, USA). Dette instrument analyserer otte farver/markører pr. rør. Ved brug af specifikke markørpaneler vil CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+/CD4+CD25+CD127/dim regulatoriske T-celler, CD4+HLA-G+ regulatoriske T-celler, myeloid-afledte suppressorceller og NK-undergrupper blive identificeret. Resultater vil blive analyseret efter inflammatorisk og immunologisk op- eller nedregulering i perioden fra dagen før operationen og op til 10 dage efter.

Immunhistokemisk analyse af tumorprøver:

Immunhistokemi vil blive udført, når alle prøver er blevet indsamlet. Invasionsdybder og antallet af celler, der udtrykker CD4, CD8, CD45RO og GZMB, vil blive analyseret. Analysen vil blive udført efter Klintrups metoder, som er en scoringsmetode fra 0-3. En score på 0 indikerer ingen stigning i de inflammatoriske celler på det dybeste punkt af tumorens invasive margin; 1 angiver en mild og pletvis stigning; 2 indikerer en fremtrædende inflammatorisk reaktion, og 3 angiver et florid kop-lignende inflammatorisk infiltrat ved den invasive kant med hyppig ødelæggelse af cancercelleøer. Disse scores klassificeres derefter som lav (0 og 1) og høj (2 og 3) karakter.

NK-celler Efter isolering af kryokonservering af PBMC'er bestemmes den funktionelle aktivitet af NK-celler in vitro ved at udsætte dem for krommærkede NK-følsomme målceller. NK-celleaktivitet kvantificeres i dette assay ved måling af chrom frigivet fra NK-cellelyserede mål.