Immunologische en oxidatieve stressrespons in relatie tot abdominale kankerchirurgie (IMOX)

Achtergrond

De peri-operatieve periode is relatief kort, maar zeer cruciaal voor kankergerelateerde overleving. De chirurgische procedure resulteert in het vrijkomen van tumorcellen lokaal en in het bloed, en inductie van een chirurgische stressrespons (SSR). Dit leidt tot verlamming van het immuunsysteem, verminderde klaring van kankercellen en optimale omstandigheden voor kankercellen om te groeien en uit tezaaien(1).

Colorectale kanker (CRC) is de derde meest voorkomende oorzaak van kanker in Denemarken. In 2013 werd bij 4196 Deense patiënten CRC(2) vastgesteld en de huidige zorgstandaard omvat een tumorresectie. Maar zelfs na een verwachte curatieve chirurgische tumorresectie krijgt 25-30% binnen 5 jaar na de primaire ingreep een recidief.

Om het resultaat na een kankeroperatie te verbeteren, is het cruciaal om in detail te begrijpen hoe SSR de immuunrespons beïnvloedt en hoe SSR het vermogen van kankercellen om te groeien en metastaseren beïnvloedt. Door expressieprofilering uit te voeren van meer dan 40.000 genen in volbloed voor en na de operatie, zullen we een genetische handtekening verkrijgen van genen van circulerende immuuncellen, waaronder granulocyten, monocyten, B- en T-cellen, dendritische cellen en bloedplaatjes, wat ons in staat zal stellen om zie de exacte impact die chirurgie heeft op gentranscriptie van deze immunologische factoren. Door deze informatie te gebruiken, kunnen perioperatieve interventies worden uitgevoerd om de immunologische respons in de perioperatieve periode te optimaliseren, wat leidt tot een verminderd risico op terugkeer van kanker en bijgevolg een betere overleving (3).

Chirurgische stressrespons (SSR) Het is algemeen bekend dat een chirurgische ingreep een verstoring van de immunologische en inflammatoire balans veroorzaakt, wat leidt tot een systemische ontstekingsreactie (4), immuunsuppressie (4,5) en een teveel aan reactieve zuurstofsoorten (ROS) (6 ,7). Systemische ontsteking bevordert de tumorgroei (8), en bij patiënten die potentieel curatieve resectie voor dikkedarmkanker hebben ondergaan, voorspelt de aanwezigheid van een systemische ontstekingsreactie een slecht resultaat (3). De verlamming van het immuunsysteem omvat verminderde activiteit van NK-cellen en macrofagen, die beide onder normale omstandigheden beschermen tegen uitzaaiingen door uitzaaiende tumorcellen te elimineren. Overmatige ROS veroorzaakt DNA-schade, afbraak van extracellulaire matrix en eliminatie van cel-celadhesies (5,6,7). Op deze manier bevordert chirurgie optimale omstandigheden voor kankercellen om te groeien en uit tezaaien in de postoperatieve fase. Recent onderzoek toont aan dat immuuncellen en hun invasie van de primaire tumor correleert met de prognose van de patiënt, wat opnieuw suggereert dat de immuunrespons belangrijk is voor het remmen van de groei van kanker(9,10). Gedetailleerde informatie over genetische veranderingen in verschillende factoren van de immuunrespons als gevolg van chirurgie blijft onduidelijk.

Onderzoeksopzet Het project bestaat uit een klinisch prospectief verkennend onderzoek met 30 patiënten die een electieve hemi-colectomie ondergaan vanwege darmkanker UICC stadium II-III. Bloedmonsters worden afgenomen op de dag voorafgaand aan de operatie en op dag 1, 2, 3 en 10 na de operatie. Er zullen monsters worden voorbereid voor flowcytometrische analyse, biobankieren, cryopreservatie en genoomprofilering van volbloed.

Genexpressieprofilering in volbloed zal worden uitgevoerd en geanalyseerd om mogelijke transcriptionele veranderingen in genen die coderen voor immunologische, inflammatoire en oxidatieve stressgerelateerde factoren veroorzaakt door chirurgie te bepalen. Het is mogelijk om zowel een kwantitatieve als een kwalitatieve meting van deze genetische veranderingen uit te voeren (11). De sondesets die voor en na de operatie het meest significant differentieel tot expressie komen, zullen worden gekozen voor verdere analyse. Genen die significant gedereguleerd zijn en beschreven zijn in eerdere studies, op het gebied van ontsteking, immunologische en oxidatieve stress, zullen worden gekozen voor verdere analyse. Voorbeelden van exacte genen binnen immunologie en ontsteking zijn genen die coderen voor TNFa, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ en HLA-G. Binnen oxidatieve en antioxidatieve genen zal speciale nadruk worden gelegd op FoxO3, TP53 en ATM, aangezien inactivatie hiervan gepaard gaat met verhoogde niveaus van ROS. Upregulatie van ATOX1, DEFB122 en GBX8 wordt geassocieerd met verhoogde niveaus van ROS, en zal ook worden gekozen voor verdere analyse (19-21).

Veranderingen in specifieke inflammatoire en immuunmodulerende eiwitten (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ en HLA-G), de functionele activiteit van natural killer (NK)-cellen en de fracties en absolute aantallen van specifieke subpopulaties van immuuncellen (CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim regulerende T-cellen, CD4+HLA-G+ regulerende T-cellen, van myeloïde afgeleide suppressorcellen en NK-subsets ) zal worden geïdentificeerd. Resultaten van genetische transcriptieanalyse en analyse van veranderingen in inflammatoire en immuunmodulerende eiwitten zullen worden vergeleken om een ​​volledig overzicht te geven van de SSR en het effect van chirurgie op immunologische, oxidatieve en inflammatoire factoren, om de mogelijke kankerverwekkende eigenschappen te evalueren. effect van chirurgie, en tijden en methoden van optimale interventie in dit schadelijke proces.

Tumormonsters van de 30 ingeschreven patiënten zullen worden geanalyseerd op de mate van invasie van immunologische cellen. De resultaten zullen worden gecorreleerd met de resultaten van genexpressieprofilering en analyse van inflammatoire en immuunmodulerende eiwitten bepaald in volbloedmonsters voorafgaand aan de operatie. Immunohistochemie zal worden uitgevoerd en inflammatoire invasie van de tumor zal worden geëvalueerd volgens de methoden van Klintrup (12) en de immunoscore (13). Deze methoden zijn gebaseerd op een scoresysteem dat het diepste punt van invasie van ontstekingscellen definieert, geïdentificeerd op basis van hematoxyline- en eosine-objectglaasjes.

methoden

Genexpressieprofilering van volbloed:

Bloedmonsters zullen worden verzameld in PAX-genbuizen en voor analyse worden verzonden naar het Odense University Hospital, Dept. of Clinical Genetics. Totaal RNA zal worden geëxtraheerd met behulp van de Paxgene Blood RNA-kit (Qiagen, Franklin Lakes, NJ, VS) en de kwaliteit van RNA zal worden getest met behulp van Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). De Message-AmpTM III RNA-amplificatiekit (Ambion, Austin, TX) zal worden gebruikt om totaal RNA om te zetten in met biotine gemerkt aRNA. Gelabeld aRNA zal worden gehybridiseerd met Affymetrix HGU133 Plus 2.0-chips. Gegevensvoorverwerking zal worden gedaan in een R-omgeving met behulp van robuuste multi-array gemiddelde expressiemaat (rma) om achtergrondcorrectie, normalisatie en expressie-indexberekening van alle microarrays uit te voeren. Verdere analyse op hoog niveau omvat geavanceerde methoden voor hoog-dimensionale gegevens, waaronder methoden onder toezicht en zonder toezicht. Vouwveranderingen zullen worden berekend en significantieanalyse van Microarray (SAM) en t-test zullen worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen te identificeren, monsters en correctie voor het testen van meerdere hypothesen zal worden uitgevoerd met behulp van de FDR-methode. Pathway-analyse zal worden toegepast om de biologische mechanismen te identificeren die worden geactiveerd door de chirurgische manipulatie, met behulp van Gene Set Enrichment Analysis (GSEA, Broad Institute).

Beoordeling van inflammatoire en immunologische markers:

Wanneer alle monsters zijn verzameld, zal een deel van het bio-banked plasma en serum worden gebruikt voor het meten van concentraties van TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ en HLA-G door ELISA's op een BEP2000 ELISA-instrument (Siemens Healthcare, Erlangen, Duitsland) bij Roskilde Hospitals, Dept.of Klinische Biochemie, waar ze veel ervaring hebben met deze maatregelen.

Analyse van subpopulaties van lekocyten:

Meerkleurige immunofenotypering van subpopulaties van leukocyten zal worden uitgevoerd binnen 1-2 uur nadat bloedmonsters zijn afgenomen. Analyse zal worden uitgevoerd met behulp van BD FACS Canto II-instrumenten (BD Biosciences, New Jersey, VS). Dit instrument analyseert acht kleuren/markers per buisje. Door het gebruik van specifieke markerpanelen zullen CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim regulerende T-cellen, CD4+HLA-G+ regulerende T-cellen, myeloïde-afgeleide suppressorcellen en NK-subsets worden geïdentificeerd. De resultaten worden geanalyseerd volgens inflammatoire en immunologische opwaartse of neerwaartse regulatie in de periode vanaf de dag vóór de operatie tot 10 dagen erna.

Immunohistochemische analyse van tumorspecimens:

Immunohistochemie zal worden uitgevoerd wanneer alle monsters zijn verzameld. Diepten van invasie en aantal cellen die CD4, CD8, CD45RO en GZMB tot expressie brengen, zullen worden geanalyseerd. De analyse zal worden uitgevoerd volgens de methoden van Klintrup, een scoremethode variërend van 0-3. Een score van 0 duidt op geen toename van de ontstekingscellen op het diepste punt van de invasieve marge van de tumor; 1 duidt op een milde en fragmentarische toename; 2 duidt op een prominente ontstekingsreactie en 3 duidt op een bloemig komvormig ontstekingsinfiltraat aan de invasieve rand met frequente vernietiging van kankerceleilanden. Deze scores worden vervolgens geclassificeerd als laag (0 en 1) en hoog (2 en 3) cijfer.

NK-cellen Na isolatie of cryopreservatie van PBMC's wordt de functionele activiteit van NK-cellen in vitro bepaald door ze bloot te stellen aan met chroom gemerkte NK-gevoelige doelcellen. De activiteit van NK-cellen wordt in deze assay gekwantificeerd door de meting van chroom dat vrijkomt uit door NK-cellen gelyseerde doelwitten.