Risposta allo stress immunologico e ossidativo in relazione alla chirurgia del cancro addominale (IMOX)

Sfondo

Il periodo perioperatorio è relativamente breve, ma altamente critico per la sopravvivenza correlata al cancro. La procedura chirurgica determina il rilascio di cellule tumorali localmente e nel sangue e l'induzione di una risposta chirurgica allo stress (SSR). Ciò porta alla paralisi del sistema immunitario, alla riduzione della clearance delle cellule tumorali e alle condizioni ottimali per la crescita e la metastasi delle cellule tumorali(1).

Il cancro del colon-retto (CRC) è la terza causa più comune di cancro in Danimarca. Nel 2013, a 4196 pazienti danesi è stato diagnosticato il CRC(2) e l'attuale standard di cura include una resezione del tumore. Tuttavia, anche dopo una prevista resezione chirurgica curativa del tumore, il 25-30% avrà una ricaduta entro 5 anni dalla procedura primaria.

Per migliorare il risultato dopo l'intervento chirurgico per il cancro, è fondamentale comprendere, in dettaglio, come l'SSR influisce sulla risposta immunitaria e come l'SSR influisce sulla capacità delle cellule tumorali di crescere e metastatizzare. Eseguendo il profilo di espressione di oltre 40.000 geni nel sangue intero prima e dopo l'intervento chirurgico, otterremo una firma genetica dei geni dalle cellule immunitarie circolanti, inclusi granulociti, monociti, cellule B e T, cellule dendritiche e piastrine, che ci consentirà di vedere l'impatto esatto che la chirurgia ha sulla trascrizione genica di questi fattori immunologici. Utilizzando queste informazioni, è possibile eseguire interventi perioperatori per ottimizzare la risposta immunologica nel periodo perioperatorio, con conseguente riduzione del rischio di recidiva del cancro e conseguente miglioramento della sopravvivenza (3).

Risposta allo stress chirurgico (SSR) È ben noto che una procedura chirurgica induce un disturbo dell'equilibrio immunologico e infiammatorio, causando una risposta infiammatoria sistemica (4), soppressione immunitaria (4,5) ed eccesso di specie reattive dell'ossigeno (ROS) (6 ,7). L'infiammazione sistemica promuove la crescita del tumore (8) e nei pazienti che sono stati sottoposti a resezione potenzialmente curativa per cancro del colon-retto, la presenza di una risposta infiammatoria sistemica predice un esito sfavorevole (3). La paralisi del sistema immunitario include una ridotta attività delle cellule NK e dei macrofagi, entrambi i quali in circostanze normali proteggono dalle metastasi eliminando le cellule tumorali in disseminazione. Un eccesso di ROS provoca danni al DNA, rottura della matrice extracellulare ed eliminazione delle aderenze cellula-cellula (5,6,7). In questo modo, la chirurgia favorisce le condizioni ottimali affinché le cellule tumorali crescano e metastatizzino nella fase post-operatoria. Ricerche recenti mostrano che le cellule immunitarie e la loro invasione del tumore primario sono correlate alla prognosi del paziente, suggerendo ancora una volta che la risposta immunitaria è importante per l'inibizione della crescita del cancro (9,10). Le informazioni dettagliate sui cambiamenti genetici in diversi fattori della risposta immunitaria dovuti alla chirurgia rimangono poco chiare.

Disegno dello studio Il progetto consiste in uno studio clinico prospettico esplorativo che include 30 pazienti sottoposti a emicolectomia elettiva per tumore del colon UICC stadio II-III. I campioni di sangue verranno raccolti il ​​giorno prima dell'intervento chirurgico e il giorno post-operatorio 1, 2, 3 e 10. I campioni saranno preparati per l'analisi citometrica a flusso, il bio banking, la crioconservazione e la profilazione genomica del sangue intero.

Il profilo di espressione genica del sangue intero sarà eseguito e analizzato per determinare possibili cambiamenti trascrizionali nei geni che codificano per fattori immunologici, infiammatori e legati allo stress ossidativo causati dalla chirurgia. È possibile effettuare una misurazione sia quantitativa che qualitativa di questi cambiamenti genetici (11). I set di sonde che risultano essere espressi in modo differenziale più significativo prima e dopo l'intervento chirurgico saranno scelti per un'ulteriore analisi. I geni che sono significativamente deregolati e sono stati descritti in studi precedenti, nel campo dell'infiammazione, dello stress immunologico e ossidativo, saranno scelti per ulteriori analisi. Esempi di geni esatti nell'ambito dell'immunologia e dell'infiammazione saranno i geni che codificano per TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ e HLA-G. Nell'ambito dei geni ossidativi e antiossidativi, particolare enfasi sarà data a FoxO3, TP53 e ATM poiché l'inattivazione di questi è associata a livelli aumentati di ROS. La sovraregolazione di ATOX1, DEFB122 e GBX8 è associata ad un aumento dei livelli di ROS, e sarà anche scelta per ulteriori analisi (19-21).

Alterazioni in specifiche proteine ​​infiammatorie e immunomodulanti (TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ e HLA-G), l'attività funzionale delle cellule natural killer (NK) e le frazioni e numeri assoluti di specifiche sottopopolazioni di cellule immunitarie (cellule T regolatorie CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim, cellule T regolatorie CD4+HLA-G+, cellule soppressori di derivazione mieloide e sottogruppi NK ) sarà identificato. I risultati dell'analisi della trascrizione genetica e dell'analisi delle alterazioni nelle proteine ​​infiammatorie e immunomodulanti, saranno confrontati al fine di fornire una panoramica completa della SSR e dell'effetto della chirurgia sui fattori immunologici, ossidativi e infiammatori, al fine di valutare il potenziale cancerogeno effetto dell'intervento chirurgico, tempi e modalità di intervento ottimale in questo processo dannoso.

I campioni tumorali dei 30 pazienti arruolati saranno analizzati per il livello di invasione delle cellule immunologiche. I risultati saranno correlati ai risultati del profilo di espressione genica e dell'analisi delle proteine ​​infiammatorie e immunomodulanti determinate in campioni di sangue intero prima dell'intervento chirurgico. L'immunoistochimica sarà eseguita e l'invasione infiammatoria del tumore sarà valutata secondo i metodi di Klintrup (12) e l'immunoscore (13). Questi metodi si basano su un sistema di punteggio che definisce il punto più profondo di invasione delle cellule infiammatorie identificate dai vetrini di ematossilina ed eosina.

Metodi

Profilazione dell'espressione genica del sangue intero:

I campioni di sangue saranno raccolti in provette con gene PAX e inviati per l'analisi all'ospedale universitario di Odense, dipartimento di genetica clinica. L'RNA totale sarà estratto utilizzando il kit Paxgene Blood RNA (Qiagen, Franklin Lakes, NJ, USA) e la qualità dell'RNA sarà testata utilizzando il bioanalizzatore Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Il kit di amplificazione dell'RNA Message-AmpTM III (Ambion, Austin, TX) verrà utilizzato per convertire l'RNA totale in aRNA marcato con biotina. L'aRNA marcato sarà ibridato con chip Affymetrix HGU133 Plus 2.0. La pre-elaborazione dei dati verrà eseguita in ambiente R utilizzando una robusta misura di espressione media multi-array (rma) per eseguire la correzione del background, la normalizzazione e il calcolo dell'indice di espressione di tutti i microarray. Ulteriori analisi di alto livello includeranno metodi avanzati per dati ad alta dimensione, inclusi metodi supervisionati e non supervisionati. Saranno calcolati i cambiamenti di piega e verranno utilizzate analisi di significatività di Microarray (SAM) e t-test per identificare i geni differenzialmente espressi, i campioni e la correzione per il test di ipotesi multiple saranno eseguiti utilizzando il metodo FDR. L'analisi del percorso verrà applicata per identificare i meccanismi biologici attivati ​​dalla manipolazione chirurgica, utilizzando l'analisi dell'arricchimento del set genico (GSEA, Broad Institute).

Valutazione dei marcatori infiammatori e immunologici:

Quando tutti i campioni saranno stati raccolti, parte del plasma e del siero della biobanca verrà utilizzata per la misurazione delle concentrazioni di TNFα, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ e HLA-G mediante ELISA su uno strumento ELISA BEP2000 (Siemens Healthcare, Erlangen, Germania) presso Roskilde Hospitals, Dept.of Biochimica clinica, dove hanno molta esperienza con queste misure.

Analisi delle sottopopolazioni di lecociti:

L'immunofenotipizzazione multicolore delle sottopopolazioni di leucociti verrà eseguita entro 1-2 ore dal prelievo dei campioni di sangue. L'analisi sarà effettuata mediante l'uso degli strumenti BD FACS Canto II (BD Biosciences, New Jersey, USA). Questo strumento analizza otto colori/marcatori per provetta. Mediante l'uso di pannelli di marker specifici verranno identificate le cellule T regolatorie CD3+CD4+, CD3+CD8+, FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim, le cellule T regolatorie CD4+HLA-G+, le cellule soppressori di derivazione mieloide e i sottoinsiemi NK. I risultati saranno analizzati in base alla regolazione up o down infiammatoria e immunologica nel periodo dal giorno prima dell'intervento chirurgico e fino a 10 giorni dopo.

Analisi immunoistochimica di campioni tumorali:

L'immunoistochimica verrà eseguita quando tutti i campioni saranno stati raccolti. Verranno analizzate le profondità di invasione e il numero di cellule che esprimono CD4, CD8, CD45RO e GZMB. L'analisi sarà eseguita secondo i metodi di Klintrup, che è un metodo di punteggio che va da 0 a 3. Un punteggio pari a 0 indica nessun aumento delle cellule infiammatorie nel punto più profondo del margine invasivo del tumore; 1 indica un aumento lieve e irregolare; 2 indica una reazione infiammatoria prominente e 3 denota un florido infiltrato infiammatorio simile a una coppa sul bordo invasivo con frequente distruzione delle isole di cellule tumorali. Questi punteggi vengono quindi classificati come basso (0 e 1) e alto (2 e 3).

Cellule NK Dopo l'isolamento mediante crioconservazione delle PBMC, l'attività funzionale delle cellule NK viene determinata in vitro esponendole a cellule bersaglio sensibili NK marcate con cromo. L'attività delle cellule NK viene quantificata in questo test mediante la misurazione del cromo rilasciato dai bersagli lisati delle cellule NK.