ウシ miRNA のヒトへの転移の検索

食事は健康と病気の過程の両方において重要な役割を果たします。遺伝子の発現と制御に対する食事の影響を研究することで、食事と健康の関係をより深く理解できるようになります。 現在最も研究されている遺伝子制御機構の 1 つは、マイクロ RNA (miRNA) の機構です。 miRNA は、転写後レベルで遺伝子発現を制御し、発生、恒常性、免疫応答、代謝、エピジェネティックなプロセスなどのプロセスに影響を与える小さな非コード RNA (約 22 ヌクレオチド) です。 miRNA は、標的 mRNA 転写物の特定の配列に結合して、翻訳を抑制したり、mRNA 分解を誘導したりします。 miRNA はさまざまな生体液中に安定して存在し、一部は遺伝子発現や細胞機能を制御するためにレシピエント細胞に直接取り込まれます。

機能的な外因性 RNA の転移は細菌およびウイルス感染において実証されていますが、哺乳動物における特徴はあまりよくわかっていません。 植物や動物に由来する食品には miRNA が含まれており、哺乳類の血清中に循環する食事由来の miRNA が検出されたという報告もあります。 これらの発見は、摂食後の哺乳動物組織への特定の miRNA の界を越えた移行を裏付けています。 しかし、植物や動物に由来する食品中に存在する miRNA が消化管によって吸収され、組織に運ばれて種間の遺伝子発現の相互制御のための制御機能を実行できるかどうかはまだ不明です。 食事由来のソースから機能性 miRNA を胃腸関門を越えて送達することは、栄養、農業、人間の健康に関連する可能性があり、治療標的化において多くの潜在的な応用が可能となる可能性があります。 食餌由来 miRNA に関する物議を醸す発見を考慮すると、哺乳動物における機能的な外因性 miRNA の伝達を決定するには、この問題を検討する必要があります。 研究者らは、メキシコ北東部では牛肉が重要な食事成分であり、牛肉の摂取が結腸直腸がんを含むさまざまな病状の潜在的な危険因子として関連付けられているため、食事由来のmiRNAが動物組織からヒト血漿に移行する可能性を研究した。

方法 研究参加者: プロトコールは倫理委員会によって承認されました。 15 人の雑食性と 15 人のビーガン (対照群) の 30 人のボランティアが研究に登録されました。 1 人の雑食動物被験者は試験を完了しませんでした。 研究への登録前に、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。 参加者の健康状態を確認するために、人体測定、血液生体測定、血清化学が実施されました。

包含基準および除外基準：インフォームド・コンセントを提供でき、同様の人体測定的特徴を有する、18～30歳の健康なボランティアが募集された。 参加者は、雑食性グループとビーガン（対照）グループの 2 つのグループに分けられました。 雑食性の被験者の参加基準は、週に少なくとも 3 回牛肉を摂取する必要があるということでした。 ビーガン被験者の参加基準は、少なくとも1年間厳格なビーガン食を実践している必要があるということでした。 すべての被験者の除外基準には、妊娠、研究サンプル収集中の月経、薬または栄養補助食品の使用、腸の吸収不良、および食事療法に含まれる成分に対する不耐症が含まれていました。

研究手順: ベースラインの血液サンプルは、12 時間の一晩絶食後に採取されました。食後の miRNA 状態は、200 g のロースト ビーフとサラダ (レタス、トマト、レンズ豆) および 1 カップの米からなる牛肉を含む食事 (試験食事) を摂取した後に測定されました。 対照食は、ローストビーフを除いて、同じ介入から構成された。 介入日ごとに、食事は生鮮食品で調理されました。 参加者は研究スタッフの管理下で食事を摂った。 食後サンプルは、食事介入の 2、4、および 6 時間後に収集されました。 被験者はサンプル採取が終わるまで再び飲食しなかった。

ヒト血漿血液サンプルは、EDTA が入った真空チューブに収集されました。標準手順に従って各時点 (0、2、4、および 6 時間) で約 5 mL の血液を採取しました。 血漿を室温で 2,000 × g で 15 分間遠心分離して分離し、分析を行うまで -80 °C で凍結しました。

RNA の分離: 血漿 RNA 抽出: 解凍した血漿サンプルを遠心分離し、血漿上清 (200 μL) を使用して低分子 RNA を含む全 RNA を精製しました。 ＲＮＡ抽出は、ｍｉＲＮｅａｓｙ血清／血漿キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して実施した。

牛肉の RNA 抽出: メーカーの指示に従って、miRNeasy Mini Kit (Qiagen) を使用して、生および調理した牛肉から低分子 RNA を含む全 RNA を抽出しました。 急速冷凍した生または調理済みの牛肉 50 mg のサンプルを 700 µL の溶解試薬に入れ、PRO200 ホモジナイザー (PRO Scientific) を使用して直ちに破砕および均質化しました。 RNA を 30 μl RNase-free 水で溶出しました。 量と純度は、Nanodrop ND-1000 を使用して測定しました。

qRT-PCR アッセイ: miRNA 1、10b、22、92a、および 192 の定量化は次のように実行されました。4 μL の全 RNA を miRNA 逆転写のテンプレートとして使用しました。 逆転写は、Universal cDNA 合成キット (Exiqon) を使用して実行しました。miRNA 血漿レベルを正規化するために、0.5 μL の合成 miRNA SPIKE (UniSp6) を各サンプルに添加しました。 hsa-miR-1-3p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-22 については、ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix およびプライマー miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR (Exiqon) を使用して、リアルタイム qPCR を実行しました。 -3p、hsa-miR-192-5p、および hsa-miR-92a-3p。 PCRプログラムおよび解離曲線分析は、LightCycle Nanoサーマルサイクラー(Roche)において、製造業者によって記載された条件下で実行された。

相対定量法が検証され、雑食動物グループの miRNA 定量化は 2-ΔΔCt 法を使用して実行されました。使用されたノーマライザーは UniSp6 の Spike であり、キャリブレーターは各時点でのコントロール グループの平均値 ΔCt (0 、2、4、6時間）。 血清および血漿サンプルの正規化のために確立された内因性コントロールが不足しているため、UniSp6 のスパイクをノーマライザーとして使用しました。 UniSp6 のスパイクとネガティブコントロールを含む各サンプルを 3 回分析しました。 データは、牛肉を含む食事後の血漿中の定量的 miRNA 検出のデータを、対照群 (ビーガン食) と比較して得られたデータです。

データ分析: miRNA の正規分布は、コルモゴロフ-スミルノフ検定によって決定されました。 記述統計は、各収集時間 (0、2、4、および 6 時間) での両方の研究グループの 2-ΔΔCt 値を使用して実行されました。 雑食動物と対照群の間の miRNA の差次的検出を、異なる食後の時点での t-スチューデント検定によって評価し、ANOVA 検定を使用した絶食時の検出と比較しました。 ピアソン相関を実行して、miRNA レベルを対照または雑食食と関連付けました。 分析は IBM SPSS Statistics 20 を使用して行われ、p <0.05 の場合に差が有意であると見なされます。