Ricerca del trasferimento di miRNA bovino verso l'uomo

La dieta gioca un ruolo importante sia nei processi di salute che di malattia; lo studio dell'influenza della dieta sull'espressione e regolazione dei geni consentirà una maggiore comprensione del rapporto tra dieta e salute. Uno dei meccanismi di regolazione genica attualmente più studiati è quello dei microRNA (miRNA). I miRNA sono piccoli RNA non codificanti (circa ~ 22 nucleotidi) che regolano l'espressione genica a livello post-trascrizionale e influenzano processi come sviluppo, omeostasi, risposta immunitaria, metabolismo e processi epigenetici. i miRNA si legano a sequenze specifiche nelle trascrizioni dell'mRNA bersaglio per reprimere la traduzione o indurre la degradazione dell'mRNA. I miRNA sono stabilmente presenti in diversi biofluidi e alcuni possono essere assorbiti direttamente dalle cellule riceventi per il controllo dell'espressione genica e delle funzioni cellulari.

Il trasferimento di RNA esogeno funzionale è stato dimostrato nelle infezioni batteriche e virali, ma è meno ben caratterizzato nei mammiferi. Gli alimenti derivati ​​da piante e animali contengono miRNA e, alcuni rapporti hanno rilevato miRNA derivati ​​dalla dieta che circolano nel siero dei mammiferi. Questi risultati supportano il trasferimento tra regni di specifici miRNA al tessuto dei mammiferi dopo il consumo di cibo. Tuttavia, non è ancora chiaro se i miRNA presenti negli alimenti derivati ​​da piante e animali possano essere assorbiti dal tratto gastrointestinale e portati nei tessuti per svolgere funzioni regolatrici per la regolazione incrociata dell'espressione genica tra specie. La fornitura di miRNA funzionali da fonti derivate dalla dieta attraverso la barriera gastrointestinale potrebbe essere rilevante per la nutrizione, l'agricoltura, la salute umana e potrebbe avere molte potenziali applicazioni nel targeting terapeutico. Alla luce delle scoperte controverse sui miRNA derivati ​​dalla dieta, la questione deve essere esaminata per determinare il trasferimento di miRNA esogeno funzionale nei mammiferi. I ricercatori hanno studiato il possibile trasferimento di miRNA derivati ​​dalla dieta dal tessuto animale al plasma umano perché la carne bovina è un importante componente della dieta nel Messico nord-orientale e il suo consumo è stato associato come potenziale fattore di rischio per diverse patologie, incluso il cancro del colon-retto.

Metodi Partecipanti allo studio: il protocollo è stato approvato da un comitato etico. Sono stati arruolati nello studio trenta volontari, quindici onnivori e quindici vegani (gruppo di controllo). Un soggetto onnivoro non ha completato il processo. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti prima dell'arruolamento nello studio. Per verificare lo stato di salute dei partecipanti sono state eseguite misure antropometriche, biometria ematica e chimica del siero.

Criteri di inclusione ed esclusione: sono stati reclutati volontari sani di età compresa tra 18 e 30 anni, in grado di fornire il consenso informato, con caratteristiche antropometriche simili. I partecipanti sono stati divisi in due gruppi: onnivori e vegani (controllo). I criteri di inclusione per i soggetti onnivori prevedevano che consumassero carne di manzo almeno tre volte alla settimana. I criteri di inclusione per i soggetti vegani erano che avrebbero dovuto seguire una rigorosa dieta vegana per almeno un anno. I criteri di esclusione per tutti i soggetti includevano gravidanza, mestruazioni durante la raccolta del campione dello studio, uso di medicinali o integratori alimentari, malassorbimento intestinale e intolleranza agli ingredienti inclusi nell'intervento dietetico.

Procedura dello studio: i campioni di sangue al basale sono stati ottenuti dopo 12 ore di digiuno notturno; lo stato del miRNA postprandiale è stato misurato dopo l'assunzione di un pasto con carne di manzo (pasto di prova) che consisteva in 200 g di roast beef con insalata (lattuga, pomodoro, lenticchie) e una tazza di riso. La dieta di controllo consisteva nello stesso intervento, senza il roast beef. Ogni giorno di intervento i pasti sono stati preparati con cibo fresco. I partecipanti hanno consumato i pasti sotto il controllo del personale dello studio. I campioni postprandiali sono stati raccolti a 2, 4 e 6 ore dopo l'intervento dietetico. I soggetti non hanno più mangiato né bevuto fino alla fine della raccolta del campione.

I campioni di sangue di plasma umano sono stati raccolti in provette sottovuoto contenenti EDTA; sono stati raccolti circa 5 mL di sangue secondo le procedure standard in ciascun punto temporale (0, 2, 4 e 6 ore). Il plasma è stato separato mediante centrifugazione per 15 minuti a 2.000 × g a temperatura ambiente seguita da congelamento a -80 ° C fino all'esecuzione delle analisi.

Isolamento degli RNA: estrazione dell'RNA dal plasma: i campioni di plasma scongelati sono stati centrifugati e il surnatante di plasma (200 µL) è stato utilizzato per purificare l'RNA totale, compresi i piccoli RNA; L'estrazione dell'RNA è stata effettuata utilizzando il kit miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore.

Estrazione dell'RNA di manzo: l'RNA totale, compresi i piccoli RNA, è stato estratto dalla carne di manzo cruda e cotta utilizzando miRNeasy Mini Kit (Qiagen) seguendo le istruzioni del produttore. Campioni di 50 mg di carne di manzo cruda o cotta surgelata istantaneamente sono stati posti in un reagente di lisi da 700 µL per la rottura e l'omogeneizzazione immediata utilizzando l'omogeneizzatore PRO200 (PRO Scientific). L'RNA è stato eluito in 30 µl di acqua priva di RNasi. La quantità e la purezza sono state determinate utilizzando un Nanodrop ND-1000.

Saggio qRT-PCR: la quantificazione dei miRNA 1, 10b, 22, 92a e 192 è stata eseguita come mostrato: 4 µ l di RNA totale sono stati usati come modello per la trascrizione inversa del miRNA. La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando il kit di sintesi del cDNA universale, (Exiqon): 0,5 μL di miRNA SPIKE sintetico (UniSp6) sono stati aggiunti a ciascun campione per la normalizzazione dei livelli plasmatici di miRNA. La qPCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix e primer miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, (Exiqon) per hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22 -3p, hsa-miR-192-5p e hsa-miR-92a-3p. Il programma PCR e l'analisi della curva di dissociazione sono stati eseguiti in un termociclatore LightCycler Nano (Roche) nelle condizioni descritte dal produttore.

Il metodo di quantificazione relativa è stato convalidato e la quantificazione del miRNA nel gruppo onnivoro è stata effettuata utilizzando il metodo 2-ΔΔCt, il normalizzatore utilizzato è stato lo Spike in UniSp6 e il calibratore è stato il valore medio ΔCt del gruppo di controllo in ciascun punto temporale (0 , 2, 4 e 6 ore). Spike in UniSp6 è stato utilizzato come normalizzatore a causa della mancanza di controlli endogeni stabiliti per la normalizzazione nei campioni di siero e plasma. Ogni campione è stato analizzato in triplicato includendo lo Spike in UniSp6 ei controlli negativi. I dati sono stati ottenuti dati per il rilevamento quantitativo di miRNA nel plasma dopo un pasto con carne di manzo rispetto al gruppo di controllo (pasto vegano).

Analisi dei dati: la distribuzione normale dei miRNA è stata determinata mediante il test di Kolmogorov-Smirnov. Le statistiche descrittive sono state eseguite con i valori 2-ΔΔCt di entrambi i gruppi di studio a ciascun tempo di raccolta (0, 2, 4 e 6 ore). Il rilevamento differenziale dei miRNA tra l'onnivoro e il gruppo di controllo è stato valutato mediante test t-student in diversi punti temporali postprandiali è stato confrontato con il rilevamento a digiuno utilizzando il test ANOVA. Sono state eseguite correlazioni di Pearson per associare i livelli di miRNA a una dieta di controllo o onnivora. L'analisi è stata effettuata con l'utilizzo di IBM SPSS Statistics 20 e le differenze sono state considerate significative se p <0,05.