Suche nach boviner miRNA-Übertragung auf Menschen

Die Ernährung spielt sowohl bei Gesundheits- als auch bei Krankheitsprozessen eine wichtige Rolle; Die Untersuchung des Einflusses der Ernährung auf die Expression und Regulierung von Genen wird ein besseres Verständnis des Zusammenhangs zwischen Ernährung und Gesundheit ermöglichen. Einer der derzeit am besten untersuchten Genregulationsmechanismen ist der der microRNAs (miRNAs). miRNAs sind kleine nichtkodierende RNA (ca. ~22 Nukleotide), die die Genexpression auf der posttranskriptionellen Ebene regulieren und Prozesse wie Entwicklung, Homöostase, Immunantwort, Stoffwechsel und epigenetische Prozesse beeinflussen. miRNAs binden an spezifische Sequenzen in Ziel-mRNA-Transkripten, um die Translation zu unterdrücken oder den mRNA-Abbau zu induzieren. miRNAs sind in verschiedenen Bioflüssigkeiten stabil vorhanden und einige können direkt von Empfängerzellen aufgenommen werden, um die Genexpression und Zellfunktionen zu steuern.

Der Transfer funktioneller exogener RNA wurde bei bakteriellen und viralen Infektionen nachgewiesen, bei Säugetieren ist er jedoch weniger gut charakterisiert. Von Pflanzen und Tieren gewonnene Lebensmittel enthalten miRNAs, und in einigen Berichten wurde festgestellt, dass aus der Nahrung stammende miRNAs im Serum von Säugetieren zirkulieren. Diese Ergebnisse unterstützen die königsübergreifende Übertragung spezifischer miRNAs auf Säugetiergewebe nach dem Verzehr von Nahrungsmitteln. Es ist jedoch immer noch unklar, ob miRNAs, die in pflanzlichen und tierischen Lebensmitteln enthalten sind, vom Magen-Darm-Trakt absorbiert und in das Gewebe gebracht werden können, um regulatorische Funktionen für die Kreuzregulierung der Genexpression zwischen Arten zu übernehmen. Die Bereitstellung funktioneller miRNAs aus Nahrungsquellen über die Magen-Darm-Barriere könnte für die Ernährung, die Landwirtschaft und die menschliche Gesundheit relevant sein und viele potenzielle Anwendungen im therapeutischen Targeting haben. Angesichts der kontroversen Erkenntnisse zu aus der Nahrung stammenden miRNAs muss die Frage untersucht werden, um den Transfer funktioneller exogener miRNA in Säugetieren zu bestimmen. Die Forscher untersuchten die mögliche Übertragung von aus der Nahrung stammenden miRNAs von tierischem Gewebe auf menschliches Plasma, da Rindfleisch im Nordosten Mexikos ein wichtiger Ernährungsbestandteil ist und sein Verzehr als potenzieller Risikofaktor für verschiedene Pathologien, einschließlich Darmkrebs, in Verbindung gebracht wird.

Methoden Studienteilnehmer: Das Protokoll wurde von einer Ethikkommission genehmigt. An der Studie nahmen 30 Freiwillige teil, davon 15 Allesfresser und 15 Veganer (Kontrollgruppe). Ein Allesfresser-Proband schloss den Versuch nicht ab. Vor der Aufnahme in die Studie wurde von allen Teilnehmern eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Um den Gesundheitszustand der Teilnehmer zu überprüfen, wurden anthropometrische Messungen, hämatische Biometrie und Serumchemie durchgeführt.

Einschluss- und Ausschlusskriterien: Es wurden gesunde Freiwillige im Alter von 18 bis 30 Jahren rekrutiert, die in der Lage waren, eine Einverständniserklärung abzugeben, und ähnliche anthropometrische Merkmale aufwiesen. Die Teilnehmer wurden in zwei Gruppen eingeteilt: Allesfresser und Veganer (Kontrolle). Einschlusskriterium für Allesfresser war, dass sie mindestens dreimal pro Woche Rindfleisch verzehren sollten. Das Einschlusskriterium für vegane Probanden war, dass sie sich mindestens ein Jahr lang strikt vegan ernährt haben sollten. Zu den Ausschlusskriterien für alle Probanden gehörten Schwangerschaft, Menstruation während der Probenentnahme, Einnahme von Medikamenten oder Nahrungsergänzungsmitteln, intestinale Malabsorption und Unverträglichkeit gegenüber den in der Diät enthaltenen Inhaltsstoffen.

Studiendurchführung: Ausgangsblutproben wurden nach 12-stündigem Fasten über Nacht entnommen; Der postprandiale miRNA-Zustand wurde nach Einnahme einer Mahlzeit mit Rindfleisch (Testmahlzeit), bestehend aus 200 g Roastbeef mit Salat (Salat, Tomate, Linsen) und einer Tasse Reis, gemessen. Die Kontrolldiät bestand aus der gleichen Intervention, jedoch ohne Roastbeef. An jedem Interventionstag wurden die Mahlzeiten mit frischen Lebensmitteln zubereitet. Die Teilnehmer aßen ihre Mahlzeiten unter der Kontrolle des Studienpersonals. Postprandiale Proben wurden 2, 4 und 6 Stunden nach der Diätintervention entnommen. Bis zum Ende der Probennahme aßen und tranken die Probanden nichts mehr.

Menschliche Plasmablutproben wurden in Vakuumröhrchen mit EDTA gesammelt; Zu jedem Zeitpunkt (0, 2, 4 und 6 Stunden) wurden gemäß Standardverfahren etwa 5 ml Blut entnommen. Das Plasma wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei 2.000 × g bei Raumtemperatur abgetrennt und anschließend bei –80 °C eingefroren, bis die Analysen durchgeführt wurden.

RNA-Isolierung: Plasma-RNA-Extraktion: Aufgetaute Plasmaproben wurden zentrifugiert und Plasmaüberstand (200 µL) wurde zur Reinigung der Gesamt-RNA einschließlich kleiner RNAs verwendet; Die RNA-Extraktion wurde mit dem miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Rindfleisch-RNA-Extraktion: Die Gesamt-RNA einschließlich kleiner RNAs wurde aus rohem und gekochtem Rindfleisch mit dem miRNeasy Mini Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Proben von 50 mg schockgefrorenem rohem oder gekochtem Rindfleisch wurden in 700 µL Lysereagenz gegeben, um sie sofort mit dem PRO200-Homogenisator (PRO Scientific) aufzubrechen und zu homogenisieren. Die RNA wurde in 30 µl RNase-freiem Wasser eluiert. Menge und Reinheit wurden mit einem Nanodrop ND-1000 bestimmt.

qRT-PCR-Assay: Die Quantifizierung der miRNAs 1, 10b, 22, 92a und 192 wurde wie gezeigt durchgeführt: 4 µL Gesamt-RNA wurden als Vorlage für die miRNA-Reverse-Transkription verwendet. Die reverse Transkription wurde mit dem Universal cDNA-Synthesekit (Exiqon) durchgeführt: 0,5 µL synthetischer miRNA SPIKE (UniSp6) wurden zu jeder Probe hinzugefügt, um die miRNA-Plasmaspiegel zu normalisieren. Echtzeit-qPCR wurde unter Verwendung des ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix und der Primer miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR (Exiqon) für hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p und hsa-miR-22 durchgeführt -3p, hsa-miR-192-5p und hsa-miR-92a-3p. Das PCR-Programm und die Dissoziationskurvenanalyse wurden in einem LightCycler Nano Thermocycler (Roche) unter den vom Hersteller beschriebenen Bedingungen durchgeführt.

Die relative Quantifizierungsmethode wurde validiert und die miRNA-Quantifizierung in der Allesfressergruppe wurde mit der Methode 2-ΔΔCt durchgeführt, der verwendete Normalisierer war der Spike in UniSp6 und der Kalibrator war der Durchschnittswert ΔCt der Kontrollgruppe zu jedem Zeitpunkt (0 , 2, 4 und 6 Stunden). Spike in UniSp6 wurde als Normalisierer verwendet, da keine endogenen Kontrollen zur Normalisierung in Serum- und Plasmaproben vorhanden waren. Jede Probe wurde dreifach analysiert, einschließlich des Spike in UniSp6 und der Negativkontrollen. Es wurden Daten zum quantitativen miRNA-Nachweis im Plasma nach einer Mahlzeit mit Rindfleisch im Vergleich zur Kontrollgruppe (vegane Mahlzeit) gewonnen.

Datenanalyse: Die Normalverteilung der miRNAs wurde durch den Kolmogorov-Smirnov-Test bestimmt. Deskriptive Statistiken wurden mit den 2-ΔΔCt-Werten beider Studiengruppen zu jedem Sammelzeitpunkt (0, 2, 4 und 6 Stunden) durchgeführt. Der unterschiedliche miRNA-Nachweis zwischen der Allesfresser- und der Kontrollgruppe wurde durch einen T-Student-Test zu verschiedenen postprandialen Zeitpunkten ausgewertet und mit dem Nüchternnachweis mithilfe des ANOVA-Tests verglichen. Pearson-Korrelationen wurden durchgeführt, um die miRNA-Spiegel einer Kontroll- oder Allesfresser-Diät zuzuordnen. Die Analyse wurde mit IBM SPSS Statistics 20 durchgeführt und Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn p <0,05.