인간으로의 소 miRNA 전이 검색

식단은 건강과 질병 과정 모두에서 중요한 역할을 합니다. 유전자의 발현과 조절에 대한 식이의 영향에 대한 연구는 식이와 건강 사이의 관계를 더 잘 이해할 수 있게 해줄 것입니다. 현재 가장 많이 연구된 유전자 조절 메커니즘 중 하나는 마이크로RNA(miRNA)의 메커니즘입니다. miRNA는 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절하고 발달, 항상성, 면역 반응, 대사 및 후성 유전 과정과 같은 과정에 영향을 미치는 작은 비암호화 RNA(약 ~22개 뉴클레오티드)입니다. miRNA는 표적 mRNA 전사체의 특정 서열에 결합하여 번역을 억제하거나 mRNA 분해를 유도합니다. miRNA는 다양한 생체액에 안정적으로 존재하며 일부는 유전자 발현 및 세포 기능을 제어하기 위해 수용 세포에 의해 직접 흡수될 수 있습니다.

기능적 외인성 RNA의 전달은 박테리아 및 바이러스 감염에서 입증되었지만 포유류에서는 잘 특성화되지 않았습니다. 식물과 동물에서 추출한 식품에는 miRNA가 포함되어 있으며 일부 보고서에서는 포유류 혈청에서 순환하는식이 유래 miRNA를 감지했습니다. 이러한 발견은 음식 섭취 후 포유류 조직으로의 특정 miRNA의 왕국 간 전달을 지원합니다. 그러나 동식물 유래 식품에 존재하는 miRNA가 위장관에서 흡수되어 조직으로 가져와 종 간 유전자 발현의 교차 조절을 위한 조절 기능을 수행할 수 있는지는 아직 확실하지 않습니다. 위장관 장벽을 통해 식이 유래 공급원으로부터 기능성 miRNA를 전달하는 것은 영양, 농업, 인간 건강과 관련이 있을 수 있으며 치료 표적화에 많은 잠재적 응용이 있을 수 있습니다. 식이 유래 miRNA에 대한 논란의 여지가 있는 발견에 비추어 볼 때 포유류에서 기능적 외인성 miRNA의 전이를 결정하기 위해서는 문제를 조사해야 합니다. 연구자들은 소고기가 멕시코 북동부 지역에서 중요한 식단 구성 요소이고 쇠고기 소비가 결장직장암을 포함한 다양한 병리의 잠재적 위험 요소로 연관되어 있기 때문에 식단에서 유래한 miRNA를 동물 조직에서 인간 혈장으로 전이할 가능성을 연구했습니다.

방법 연구 참여자: 프로토콜은 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 30명의 지원자, 15명의 잡식성 및 15명의 채식주의자(대조군)가 연구에 등록되었습니다. 한 잡식성 피험자는 시험을 완료하지 못했습니다. 연구에 등록하기 전에 모든 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다. 참가자의 건강 상태를 확인하기 위해 인체 측정, 혈액 생체 측정 및 혈청 화학을 수행했습니다.

포함 및 제외 기준: 18세에서 30세 사이의 건강한 지원자가 정보에 입각한 동의를 제공할 수 있고 유사한 인체 특성을 가지고 모집되었습니다. 참가자들은 잡식성 그룹과 비건 그룹(대조군)의 두 그룹으로 나뉘었습니다. 잡식성 대상자에 대한 포함 기준은 일주일에 적어도 3회 쇠고기를 섭취해야 한다는 것이었다. 완전채식 대상자의 포함 기준은 최소 1년 동안 엄격한 완전채식을 따라야 한다는 것이었습니다. 모든 피험자에 대한 제외 기준에는 임신, 연구 샘플 수집 중 월경, 의약품 또는 식품 보충제 사용, 장 흡수 장애 및 식이 개입에 포함된 성분에 대한 불내성이 포함되었습니다.

연구 절차: 기준선 혈액 샘플은 12시간 밤새 금식한 후에 얻었습니다. 식후 miRNA 상태는 200g의 로스트 비프와 샐러드(양상추, 토마토, 렌즈콩) 및 쌀 한 컵으로 구성된 쇠고기 식사(시험 식사)를 섭취한 후에 측정되었습니다. 대조군 식단은 로스트 비프 없이 동일한 개입으로 구성되었습니다. 각 개입 일 식사는 신선한 음식으로 준비되었습니다. 참가자들은 연구 직원의 통제하에 식사를 했습니다. 식후 샘플은 식이 개입 후 2, 4 및 6시간에 수집되었습니다. 피험자는 샘플 수집이 끝날 때까지 다시 먹거나 마시지 않았습니다.

인간 혈장 혈액 샘플을 EDTA가 포함된 진공관에 수집했습니다. 각 시점(0, 2, 4 및 6시간)에서 표준 절차에 따라 약 5mL의 혈액을 수집했습니다. 혈장을 실온에서 2,000 x g에서 15분 동안 원심분리한 다음 분석이 수행될 때까지 -80 °C에서 동결하여 분리했습니다.

RNA 분리: 혈장 RNA 추출: 해동된 혈장 샘플을 원심분리하고 혈장 상청액(200 μL)을 작은 RNA를 포함한 총 RNA 정제에 사용했습니다. miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 RNA 추출을 수행했습니다.

쇠고기 RNA 추출: 제조업체의 지침에 따라 miRNeasy Mini Kit(Qiagen)을 사용하여 생고기 및 조리된 쇠고기에서 small RNA를 포함한 총 RNA를 추출했습니다. PRO200 균질화기(PRO Scientific)를 사용하여 즉시 냉동된 생고기 또는 조리된 소고기 50mg 샘플을 분해 및 균질화를 위해 700µL 용해 시약에 넣었습니다. RNA는 30 μl RNase-free water에서 용출되었습니다. Nanodrop ND-1000을 사용하여 정량 및 순도를 결정했습니다.

qRT-PCR 분석: miRNA 1, 10b, 22, 92a 및 192의 정량화는 다음과 같이 수행되었습니다. 총 RNA 4μL를 miRNA 역전사를 위한 주형으로 사용했습니다. Universal cDNA 합성 키트(Exiqon)를 사용하여 역전사를 수행했습니다. miRNA 혈장 수준의 정상화를 위해 0.5 μL의 합성 miRNA SPIKE(UniSp6)를 각 샘플에 추가했습니다. ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix 및 프라이머 miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR(Exiqon) for hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22를 사용하여 실시간 qPCR을 수행했습니다. -3p, hsa-miR-192-5p 및 hsa-miR-92a-3p. PCR 프로그램과 해리곡선 분석은 LightCycler Nano thermal cycler(Roche)에서 제조사에서 제시한 조건으로 수행하였다.

상대정량법을 검증하여 잡식동물군에서의 miRNA 정량은 방법 2-ΔΔCt를 이용하여 수행하였으며, 사용된 normalizer는 UniSp6의 Spike를 사용하였고 calibrator는 각 시점에서 대조군의 평균값 ΔCt(0 , 2, 4 및 6시간). UniSp6의 스파이크는 혈청 및 혈장 샘플의 정규화를 위해 확립된 내인성 대조군이 없기 때문에 정규화 장치로 사용되었습니다. UniSp6의 스파이크 및 음성 대조군을 포함하여 각 샘플을 3회 분석했습니다. 대조군(비건 식사)과 비교하여 소고기 식사 후 혈장에서 정량적 miRNA 검출에 대한 데이터를 얻었습니다.

데이터 분석: miRNA 정규 분포는 Kolmogorov-Smirnov 테스트에 의해 결정되었습니다. 기술 통계는 각 수집 시간(0, 2, 4 및 6시간)에서 두 연구 그룹의 2-ΔΔCt 값으로 수행되었습니다. 잡식 동물과 대조군 사이의 miRNA 차등 검출은 서로 다른 식후 시점에서 t-student 테스트로 평가되었으며 ANOVA 테스트를 사용한 공복 검출과 비교되었습니다. Pearson 상관 관계는 miRNA 수준을 대조군 또는 잡식성 식단과 연관시키기 위해 수행되었습니다. 분석은 IBM SPSS Statistics 20을 사용하여 수행되었으며 p<0.05인 경우 차이가 유의한 것으로 간주되었습니다.