Keresés a szarvasmarha miRNS transzfer emberre

Az étrend fontos szerepet játszik mind az egészségügyi, mind a betegségi folyamatokban; az étrendnek a gének expressziójára és szabályozására gyakorolt ​​hatásának tanulmányozása lehetővé teszi az étrend és az egészség közötti kapcsolat jobb megértését. Jelenleg az egyik legtöbbet tanulmányozott génszabályozási mechanizmus a mikroRNS-ek (miRNS-ek). A miRNS-ek kisméretű, nem kódoló RNS-ek (körülbelül ~22 nukleotid), amelyek szabályozzák a génexpressziót a transzkripció utáni szinten, és befolyásolják az olyan folyamatokat, mint a fejlődés, a homeosztázis, az immunválasz, az anyagcsere és az epigenetikai folyamatok. A miRNS-ek specifikus szekvenciákhoz kötődnek a cél-mRNS-transzkriptumokban, hogy elnyomják a transzlációt vagy indukálják az mRNS lebomlását. A miRNS-ek stabilan jelen vannak különböző biofluidokban, és néhányat közvetlenül felvehetnek a recipiens sejtek a génexpresszió és a sejtfunkciók szabályozására.

A funkcionális exogén RNS átvitelét kimutatták bakteriális és vírusos fertőzésekben, de emlősökben kevésbé jól jellemezhető. A növényekből és állatokból származó élelmiszerek miRNS-eket tartalmaznak, és egyes jelentések kimutatták, hogy étrendből származó miRNS-ek keringenek az emlős szérumában. Ezek az eredmények alátámasztják a specifikus miRNS-ek birodalmakon átívelő átvitelét az emlősök szövetébe táplálékfogyasztás után. Azonban még mindig nem világos, hogy a növényekből és állatokból származó élelmiszerekben jelenlévő miRNS-ek felszívódhatnak-e a gyomor-bél traktusban, és eljuthatnak-e a szövetekbe, hogy szabályozó funkciókat hajtsanak végre a fajok közötti génexpresszió keresztszabályozásában. A funkcionális miRNS-ek diétából származó forrásokból a gasztrointesztinális gáton keresztül történő eljuttatása fontos lehet a táplálkozás, a mezőgazdaság és az emberi egészség szempontjából, és számos potenciális alkalmazást jelenthet a terápiás célzásban. Az étrendből származó miRNS-ekkel kapcsolatos ellentmondásos eredmények fényében meg kell vizsgálni a kérdést, hogy meghatározzuk a funkcionális exogén miRNS átvitelét emlősökben. A kutatók tanulmányozták az étrendből származó miRNS-ek lehetséges átvitelét az állati szövetből az emberi plazmába, mivel a marhahús fontos étrend-összetevő Északkelet-Mexikóban, és fogyasztása különböző kórképek, köztük a vastagbélrák potenciális kockázati tényezőjeként társult.

Módszerek A vizsgálat résztvevői: A protokollt egy etikai bizottság hagyta jóvá. Harminc önkéntest, tizenöt mindenevőt és tizenöt vegánt (kontrollcsoport) vontak be a vizsgálatba. Egy mindenevő alany nem fejezte be a vizsgálatot. A vizsgálatba való beiratkozás előtt minden résztvevőtől írásos beleegyezést kaptak. A résztvevők egészségi állapotának ellenőrzésére antropometriai méréseket, hematikus biometriát és szérumkémiai vizsgálatokat végeztek.

Bevételi és kizárási kritériumok: 18 és 30 év közötti egészséges önkénteseket vettek fel, akik képesek voltak tájékozott beleegyezést adni, hasonló antropometriai jellemzőkkel. A résztvevőket két csoportra osztották: mindenevőre és vegánra (kontroll). A mindenevő alanyok felvételi kritériuma az volt, hogy hetente legalább háromszor marhahúst kell fogyasztaniuk. A vegán alanyok felvételi kritériuma az volt, hogy legalább egy évig szigorú vegán étrendet kellett követniük. Valamennyi alany esetében a kizárási kritériumok közé tartozott a terhesség, a menstruáció a vizsgálati mintagyűjtés során, a gyógyszerek vagy étrend-kiegészítők használata, a bélrendszeri felszívódási zavar és a diétás beavatkozásban szereplő összetevők intoleranciája.

Vizsgálati eljárás: A kiindulási vérmintákat 12 óra éjszakai éheztetés után vettük; az étkezés utáni miRNS állapotot egy marhahúsos étkezés (tesztétel) elfogyasztása után mértük, amely 200 g marhasültből salátával (saláta, paradicsom, lencse) és egy csésze rizsből állt. A kontroll diéta ugyanebből a beavatkozásból állt, marhasült nélkül. Minden beavatkozási napon friss ételekkel készültek az ételek. A résztvevők a vizsgálati személyzet ellenőrzése alatt étkeztek. Az étkezés utáni mintákat a diétás beavatkozás után 2, 4 és 6 órával vettük. Az alanyok ismét nem ettek és nem ittak a mintagyűjtés végéig.

A humán plazma vérmintákat EDTA-t tartalmazó vákuumcsövekbe gyűjtöttük; körülbelül 5 ml vért vettünk a standard eljárások szerint minden időpontban (0, 2, 4 és 6 óra). A plazmát centrifugálással választottuk el 15 percig 2000 x g-vel szobahőmérsékleten, majd -80 °C-on fagyasztottuk az elemzések elvégzéséig.

RNS-ek izolálása: Plazma RNS extrakció: a felolvasztott plazmamintákat centrifugáltuk, és plazma felülúszót (200 µL) használtunk a teljes RNS tisztítására, beleértve a kis RNS-eket is; Az RNS extrakciót a miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) segítségével végeztük a gyártó utasításai szerint.

Marhahús RNS-kivonása: A teljes RNS-t, beleértve a kis RNS-eket is, nyers és főtt marhahúsból vontuk ki a miRNeasy Mini Kit (Qiagen) segítségével a gyártó utasításait követve. Az 50 mg-os gyorsfagyasztott nyers vagy főtt marhahús mintáit 700 µl-es lízisreagensbe helyeztük, hogy a PRO200 homogenizátor (PRO Scientific) segítségével azonnal megtörjük és homogenizáljuk. Az RNS-t 30 µl RNáz-mentes vízben eluáltuk. A mennyiséget és a tisztaságot Nanodrop ND-1000 készülékkel határoztuk meg.

qRT-PCR vizsgálat: Az 1., 10b., 22., 92a. és 192. miRNS mennyiségi meghatározását a bemutatott módon végeztük: 4 µl teljes RNS-t használtunk templátként a miRNS reverz transzkripciójához. A reverz transzkripciót Universal cDNS szintézis készlettel (Exiqon) végeztük: 0,5 µl szintetikus miRNS SPIKE-t (UniSp6) adtunk minden mintához a miRNS plazmaszintek normalizálására. A valós idejű qPCR-t az ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix és a miRCURY LNA Universal RT microRNS PCR, (Exiqon) primerek segítségével végeztük a hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22 számára. -3p, hsa-miR-192-5p és hsa-miR-92a-3p. A PCR-programot és a disszociációs görbe elemzését LightCycler Nano termikus ciklusban (Roche) végeztük a gyártó által leírt körülmények között.

A relatív mennyiségi meghatározási módszert validáltuk, és a miRNS mennyiségi meghatározását a mindenevők csoportjában a 2-ΔΔCt módszerrel végeztük, a normalizálóként a Spike in UniSp6-t, a kalibrátorként pedig a kontrollcsoport átlagos ΔCt értékét használtuk minden időpontban (0 , 2, 4 és 6 óra). Az UniSp6 spike-jét normalizálóként használták, mivel hiányoztak a szérum- és plazmaminták normalizálására létrehozott endogén kontrollok. Minden mintát három párhuzamosban elemeztünk, beleértve a Spike-ot az UniSp6-ban és a negatív kontrollokat. A marhahús étkezés utáni plazma mennyiségi miRNS kimutatására vonatkozó adatokat a kontroll csoporttal (vegán étkezés) összehasonlítva szereztük be.

Adatelemzés: A miRNS-ek normál eloszlását Kolmogorov-Smirnov teszttel határoztuk meg. A leíró statisztikákat mindkét vizsgálati csoport 2-ΔΔCt értékeivel végeztük minden egyes gyűjtési időpontban (0, 2, 4 és 6 óra). A miRNS-ek differenciális detektálását a mindenevő és a kontrollcsoport között t-student teszttel értékeltük, különböző posztprandiális időpontokban, és ANOVA teszttel hasonlítottuk össze az éhgyomri kimutatással. Pearson-korrelációkat végeztek, hogy a miRNS-szinteket a kontroll vagy mindenevő étrendhez társítsák. Az elemzés az IBM SPSS Statistics 20 segítségével történt, és a különbségeket szignifikánsnak tekintettük, ha p <0,05.