搜索牛 miRNA 向人类的转移

饮食在健康和疾病过程中都起着重要作用；研究饮食对基因表达和调节的影响，将使人们更好地了解饮食与健康之间的关系。 目前研究最多的基因调控机制之一是微小 RNA (miRNA)。 miRNA 是一种小的非编码 RNA（约 22 个核苷酸），可在转录后水平调节基因表达并影响发育、稳态、免疫反应、新陈代谢和表观遗传过程等过程。 miRNA 结合目标 mRNA 转录物中的特定序列以抑制翻译或诱导 mRNA 降解。 miRNA 稳定存在于不同的生物体液中，有些可以直接被受体细胞吸收，以控制基因表达和细胞功能。

功能性外源性 RNA 的转移已在细菌和病毒感染中得到证实，但在哺乳动物中的特征较少。 来自植物和动物的食物含有 miRNA，并且一些报告已经检测到在哺乳动物血清中循环的源自饮食的 miRNA。 这些发现支持特定 miRNA 在食物消耗后跨界转移到哺乳动物组织。 然而，目前尚不清楚植物和动物来源的食物中存在的 miRNA 是否可以被胃肠道吸收并带到组织中以执行物种间基因表达交叉调节的调节功能。 通过胃肠道屏障从饮食来源输送功能性 miRNA 可能与营养、农业、人类健康相关，并且可能在治疗靶向方面具有许多潜在应用。 鉴于关于饮食来源的 miRNA 的有争议的发现，必须检查这个问题以确定哺乳动物中功能性外源性 miRNA 的转移。 研究人员研究了饮食来源的 miRNAs 从动物组织转移到人体血浆的可能性，因为牛肉是墨西哥东北部的重要饮食成分，并且其消费与不同病理学（包括结直肠癌）的潜在危险因素有关。

方法 研究参与者：该方案经伦理委员会批准。 30 名志愿者、15 名杂食者和 15 名纯素食者（对照组）参与了这项研究。 一名杂食动物受试者没有完成试验。 在参加研究之前，已获得所有参与者的书面知情同意书。 为了验证参与者的健康状况，进行了人体测量、血液生物测定和血清化学。

纳入和排除标准：招募年龄在 18 至 30 岁之间、能够提供知情同意、具有相似人体测量学特征的健康志愿者。 参与者被分为两组：杂食者和纯素食者（对照组）。 杂食性受试者的纳入标准是他们每周至少吃 3 次牛肉。 纯素受试者的纳入标准是他们应该遵循严格的纯素饮食至少一年。 所有受试者的排除标准包括怀孕、研究样本收集期间的月经、使用药物或食品补充剂、肠道吸收不良和对饮食干预中包含的成分不耐受。

研究程序： 基线血液样本在禁食 12 小时后获取；在摄入牛肉餐（测试餐）后测量餐后 miRNA 状态，该餐由 200 克烤牛肉配沙拉（生菜、西红柿、扁豆）和一杯米饭组成。 对照饮食由相同的干预组成，但不含烤牛肉。 每个干预日的饭菜都是用新鲜食物准备的。 参与者在研究人员的控制下进餐。 在饮食干预后 2、4 和 6 小时收集餐后样本。 直到样本采集结束，受试者才再次进食或饮水。

将人血浆血液样本收集到含有 EDTA 的真空管中；根据标准程序在每个时间点（0、2、4和6小时）收集大约5mL血液。 通过在室温下以 2,000 × g 离心 15 分钟分离血浆，然后在 -80 °C 冷冻直至进行分析。

RNA 分离：血浆 RNA 提取：将解冻的血浆样品离心，血浆上清液 (200 µL) 用于纯化包括小 RNA 在内的总 RNA；根据制造商的说明，使用 miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) 进行 RNA 提取。

牛肉 RNA 提取：按照制造商的说明，使用 miRNeasy Mini Kit (Qiagen) 从生牛肉和熟牛肉中提取总 RNA，包括小 RNA。 将 50 mg 速冻生牛肉或熟牛肉样品放入 700µL 裂解试剂中，立即使用 PRO200 均质器 (PRO Scientific) 进行破碎和均质化。 RNA 在 30 µl 无 RNase 的水中洗脱。 使用 Nanodrop ND-1000 测定数量和纯度。

qRT-PCR 测定：miRNA 1、10b、22、92a 和 192 的定量如下所示：4 µL 总 RNA 用作 miRNA 逆转录的模板。 使用通用 cDNA 合成试剂盒 (Exiqon) 进行逆转录：将 0.5 µL 合成 miRNA SPIKE (UniSp6) 添加到每个样本中，以实现 miRNA 血浆水平的标准化。 使用 ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix 和引物 miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, (Exiqon) for hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22 进行实时 qPCR -3p、hsa-miR-192-5p 和 hsa-miR-92a-3p。 PCR程序和解离曲线分析在制造商描述的条件下在LightCycler Nano热循环仪(Roche)中进行。

验证相对定量方法，杂食动物组miRNA定量采用2-ΔΔCt方法，标准品为UniSp6中的Spike，校准品为对照组各时间点的平均值ΔCt（0 、2、4 和 6 小时）。 由于缺乏为血清和血浆样本标准化而建立的内源性对照，UniSp6 中的加标被用作标准化剂。 每个样品一式三份进行分析，包括 UniSp6 中的加标和阴性对照。 与对照组（素食餐）相比，获得牛肉餐后血浆中定量 miRNA 检测的数据。

数据分析：通过Kolmogorov-Smirnov检验确定miRNA的正态分布。 使用两个研究组在每个收集时间（0、2、4 和 6 小时）的 2-ΔΔCt 值进行描述性统计。 杂食动物和对照组之间的 miRNA 差异检测通过 t-student 测试在不同的餐后时间点进行评估，并与使用 ANOVA 测试的空腹检测进行比较。 执行 Pearson 相关性以将 miRNA 水平与对照或杂食性饮食相关联。 分析是使用 IBM SPSS Statistics 20 完成的，如果 p <0.05，则认为差异显着。