Etsi naudan miRNA:n siirto ihmisiin

Ruokavaliolla on tärkeä rooli sekä terveys- että sairausprosesseissa; Tutkimus ruokavalion vaikutuksesta geenien ilmentymiseen ja säätelyyn mahdollistaa paremman ruokavalion ja terveyden välisen suhteen ymmärtämisen. Yksi tällä hetkellä tutkituimmista geenisäätelymekanismeista on mikroRNA:iden (miRNA:iden) geenisäätelymekanismeja. miRNA:t ovat pieniä ei-koodaavia RNA:ita (noin ~22 nukleotidia), jotka säätelevät geenien ilmentymistä transkription jälkeisellä tasolla ja vaikuttavat prosesseihin, kuten kehitykseen, homeostaasiin, immuunivasteeseen, aineenvaihduntaan ja epigeneettisiin prosesseihin. miRNA:t sitoutuvat spesifisiin sekvensseihin kohde-mRNA-transkripteissä repressoidakseen translaation tai indusoidakseen mRNA:n hajoamista. miRNA:t ovat stabiilisti läsnä erilaisissa biofluideissa, ja vastaanottajasolut voivat ottaa osan suoraan vastaan ​​geeniekspression ja solutoimintojen säätelemiseksi.

Toiminnallisen eksogeenisen RNA:n siirtyminen on osoitettu bakteeri- ja virusinfektioissa, mutta se on huonommin karakterisoitu nisäkkäillä. Kasveista ja eläimistä saadut ruoat sisältävät miRNA:ita, ja joissakin raporteissa on havaittu ruokavaliosta peräisin olevia miRNA:ita kiertävän nisäkkään seerumissa. Nämä havainnot tukevat spesifisten miRNA:iden valtakuntien välistä siirtymistä nisäkäskudokseen ruoan kulutuksen jälkeen. On kuitenkin edelleen epäselvää, voivatko kasveista ja eläimistä saadussa ruoassa olevat miRNA:t imeytyä maha-suolikanavaan ja viedä kudoksiin suorittamaan säätelytoimintoja lajien välisen geeniekspression ristisäätelyssä. Toiminnallisten miRNA:iden toimittaminen ruokavaliosta johdetuista lähteistä maha-suolikanavan esteen yli voi olla merkityksellistä ravitsemuksen, maatalouden ja ihmisten terveyden kannalta, ja sillä voi olla monia potentiaalisia sovelluksia terapeuttisessa kohdentamisessa. Ruokavalioperäisiä miRNA:ita koskevien kiistanalaisten löydösten valossa kysymystä on tutkittava funktionaalisen eksogeenisen miRNA:n siirtymisen määrittämiseksi nisäkkäissä. Tutkijat tutkivat ruokavalioperäisten miRNA:iden mahdollista siirtymistä eläinkudoksesta ihmisen plasmaan, koska naudanliha on tärkeä ruokavalion komponentti Koillis-Meksikossa ja sen kulutus on yhdistetty mahdolliseksi riskitekijäksi erilaisille patologioille, mukaan lukien paksusuolen syöpä.

Menetelmät Tutkimuksen osallistujat: Protokollan hyväksyi eettinen komitea. Kolmekymmentä vapaaehtoista, viisitoista kaikkiruokaista ja viisitoista vegaania (verrokkiryhmä), otettiin mukaan tutkimukseen. Yksi kaikkiruokainen koehenkilö ei suorittanut koetta loppuun. Kaikilta osallistujilta hankittiin kirjallinen tietoinen suostumus ennen tutkimukseen ilmoittautumista. Osallistujien terveydentilan tarkistamiseksi suoritettiin antropometrisiä mittauksia, hemaattista biometriaa ja seerumikemiaa.

Sisällyttämis- ja poissulkemiskriteerit: Rekrytoitiin 18–30-vuotiaita terveitä vapaaehtoisia, jotka pystyivät antamaan tietoisen suostumuksen ja joilla oli samanlaiset antropometriset ominaisuudet. Osallistujat jaettiin kahteen ryhmään: kaikkiruokaiset ja vegaani (verrokki). Kaikkiruokaisten koehenkilöiden mukaanottokriteerinä oli, että heidän tulisi syödä naudanlihaa vähintään kolme kertaa viikossa. Vegaanikoehenkilöiden mukaanottokriteerinä oli, että heidän olisi pitänyt noudattaa tiukkaa vegaaniruokavaliota vähintään vuoden ajan. Kaikkien koehenkilöiden poissulkemiskriteereinä olivat raskaus, kuukautiset tutkimusnäytteenoton aikana, lääkkeiden tai ravintolisien käyttö, suoliston imeytymishäiriö ja ruokavaliointerventioon sisältyvien ainesosien intoleranssi.

Tutkimusmenettely: Perustason verinäytteet otettiin 12 tunnin yön yli paaston jälkeen; aterian jälkeinen miRNA-tila mitattiin naudanliha-aterian (koeateria) nauttimisen jälkeen, joka sisälsi 200 g paahtopaistia salaatin (salaatti, tomaatti, linssit) ja kupillisen riisiä kanssa. Kontrolliruokavalio koostui samasta interventiosta ilman paahdettua lihaa. Joka interventiopäivä ateriat valmistettiin tuoreella ruoalla. Osallistujat söivät aterioita tutkimushenkilöstön valvonnassa. Aterian jälkeiset näytteet kerättiin 2, 4 ja 6 tunnin kuluttua ruokavaliointerventiosta. Koehenkilöt eivät syöneet tai juoneet uudelleen ennen näytteenoton päättymistä.

Ihmisen plasmaverinäytteet kerättiin tyhjiöputkiin, jotka sisälsivät EDTA:ta; noin 5 ml verta kerättiin standardimenetelmien mukaisesti kullakin aikapisteellä (0, 2, 4 ja 6 tuntia). Plasma erotettiin sentrifugoimalla 15 minuuttia nopeudella 2 000 x g huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen se jäädytettiin -80 °C:ssa, kunnes analyysit suoritettiin.

RNA:iden eristäminen: Plasma-RNA:n uutto: sulatetut plasmanäytteet sentrifugoitiin ja plasmasupernatanttia (200 ui) käytettiin kokonais-RNA:n, mukaan lukien pienet RNA:t, puhdistamiseen; RNA-uutto suoritettiin käyttämällä miRNeasy Serum/Plasma Kit -sarjaa (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Naudan RNA:n uuttaminen: Kokonais-RNA, mukaan lukien pienet RNA:t, uutettiin raa'asta ja kypsennetystä naudanlihasta käyttämällä miRNeasy Mini Kitiä (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Näytteet 50 mg pakastettua raakaa tai keitettyä naudanlihaa laitettiin 700 µl:aan lyysireagenssia hajottamista ja homogenointia varten välittömästi käyttämällä PRO200-homogenisaattoria (PRO Scientific). RNA eluoitiin 30 ul:ssa RNaasi-vapaata vettä. Määrä ja puhtaus määritettiin käyttämällä Nanodrop ND-1000:ta.

qRT-PCR-määritys: MiRNA:iden 1, 10b, 22, 92a ja 192 kvantifiointi suoritettiin esitetyllä tavalla: 4 ui kokonais-RNA:ta käytettiin templaattina miRNA:n käänteistranskriptioon. Käänteistranskriptio suoritettiin käyttämällä Universal cDNA -synteesipakkausta (Exiqon): 0,5 ui synteettistä miRNA SPIKEä (UniSp6) lisättiin jokaiseen näytteeseen miRNA-plasmatasojen normalisoimiseksi. Reaaliaikainen qPCR suoritettiin käyttämällä ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mixiä ja alukkeita miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, (Exiqon) varten hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22 -3p, hsa-miR-192-5p ja hsa-miR-92a-3p. PCR-ohjelma ja dissosiaatiokäyräanalyysi suoritettiin LightCycler Nano -lämpösyklilaitteessa (Roche) valmistajan kuvaamissa olosuhteissa.

Suhteellinen kvantifiointimenetelmä validoitiin ja miRNA:n kvantifiointi kaikkiruokaisessa ryhmässä suoritettiin menetelmällä 2-ΔΔCt, normalisoijana oli Spike in UniSp6 ja kalibraattorina kontrolliryhmän keskiarvo ΔCt kullakin aikapisteellä (0 , 2, 4 ja 6 tuntia). UniSp6:n piikkiä käytettiin normalisoijana, koska seerumi- ja plasmanäytteiden normalisoimiseksi ei ollut vahvistettu endogeenisiä kontrolleja. Jokainen näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena, mukaan lukien Spike in UniSp6 ja negatiiviset kontrollit. Tiedot saatiin kvantitatiivisesta miRNA:n havaitsemisesta plasmassa naudanliha-aterian jälkeen verrattuna kontrolliryhmään (vegaaniateria).

Data-analyysi: MiRNA:iden normaalijakauma määritettiin Kolmogorov-Smirnov-testillä. Kuvaavat tilastot suoritettiin molempien tutkimusryhmien 2-ΔΔCt-arvoilla kullakin keräyskerralla (0, 2, 4 ja 6 tuntia). miRNA:iden differentiaalista havaitsemista kaikkiruokaisen ja kontrolliryhmän välillä arvioitiin t-opiskelijatestillä eri aterian jälkeisinä ajankohtina, ja sitä verrattiin paaston havaitsemiseen ANOVA-testillä. Pearson-korrelaatiot suoritettiin miRNA-tasojen yhdistämiseksi kontrolli- tai kaikkiruokavalioon. Analyysi suoritettiin käyttämällä IBM SPSS Statistics 20 -ohjelmaa ja eroja pidettiin merkitsevinä, jos p < 0,05.