Поиск передачи бычьей микроРНК человеку

Диета играет важную роль как для здоровья, так и для болезней; изучение влияния диеты на экспрессию и регуляцию генов позволит лучше понять взаимосвязь между диетой и здоровьем. В настоящее время одним из наиболее изученных механизмов регуляции генов являются микроРНК (миРНК). микроРНК представляют собой малые некодирующие РНК (примерно ~22 нуклеотида), которые регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне и влияют на такие процессы, как развитие, гомеостаз, иммунный ответ, метаболизм и эпигенетические процессы. miRNAs связываются со специфическими последовательностями в транскриптах мРНК-мишеней, подавляя трансляцию или индуцируя деградацию мРНК. миРНК стабильно присутствуют в различных биологических жидкостях, и некоторые из них могут напрямую поглощаться клетками-реципиентами для контроля экспрессии генов и клеточных функций.

Перенос функциональной экзогенной РНК был продемонстрирован при бактериальных и вирусных инфекциях, но менее хорошо охарактеризован у млекопитающих. Пищевые продукты, полученные из растений и животных, содержат микроРНК, и в некоторых сообщениях обнаружены микроРНК, полученные из рациона, циркулирующие в сыворотке млекопитающих. Эти находки подтверждают межцарственный перенос специфических miRNAs в ткани млекопитающих после употребления пищи. Однако до сих пор неясно, могут ли микроРНК, присутствующие в пище, полученной из растений и животных, поглощаться желудочно-кишечным трактом и доставляться в ткани для выполнения регуляторных функций перекрестной регуляции экспрессии генов между видами. Доставка функциональных микроРНК из пищевых источников через желудочно-кишечный барьер может иметь отношение к питанию, сельскому хозяйству, здоровью человека и может иметь множество потенциальных применений в терапевтическом нацеливании. В свете противоречивых данных о miRNAs, происходящих из рациона, этот вопрос должен быть изучен, чтобы определить перенос функциональной экзогенной miRNA у млекопитающих. Исследователи изучили возможный перенос микроРНК, полученных из пищи, из тканей животных в плазму человека, поскольку говядина является важным компонентом диеты на северо-востоке Мексики, и ее потребление было связано с потенциальным фактором риска различных патологий, включая колоректальный рак.

Методы. Участники исследования. Протокол одобрен этическим комитетом. В исследовании приняли участие 30 добровольцев, 15 всеядных и 15 веганов (контрольная группа). Один всеядный субъект не завершил испытание. Письменное информированное согласие было получено от всех участников до включения в исследование. Для проверки состояния здоровья участников были выполнены антропометрические измерения, биометрия крови и биохимия сыворотки.

Критерии включения и исключения: были набраны здоровые добровольцы в возрасте от 18 до 30 лет, способные дать информированное согласие, со схожими антропометрическими характеристиками. Участники были разделены на две группы: всеядные и веганы (контроль). Критерием включения всеядных субъектов было то, что они должны потреблять говядину не менее трех раз в неделю. Критерием включения для веганов было то, что они должны были соблюдать строгую веганскую диету в течение как минимум одного года. Критерии исключения для всех субъектов включали беременность, менструацию во время сбора образцов для исследования, прием лекарств или пищевых добавок, нарушение всасывания в кишечнике и непереносимость ингредиентов, включенных в диетическое вмешательство.

Процедура исследования: Исходные образцы крови были получены после 12-часового голодания в течение ночи; постпрандиальное состояние микроРНК измеряли после приема пищи с говядиной (тестовая еда), которая состояла из 200 г ростбифа с салатом (салат, помидоры, чечевица) и чашкой риса. Контрольная диета состояла из того же вмешательства, но без ростбифа. В каждый день вмешательства пища готовилась из свежих продуктов. Участники принимали пищу под контролем исследовательского персонала. Постпрандиальные пробы собирали через 2, 4 и 6 часов после введения диеты. Субъекты больше не ели и не пили до окончания сбора проб.

Образцы плазмы крови человека собирали в вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА; приблизительно 5 мл крови собирали в соответствии со стандартными процедурами в каждый момент времени (0, 2, 4 и 6 часов). Плазму отделяли центрифугированием в течение 15 минут при 2000 g при комнатной температуре с последующим замораживанием при -80 °C до проведения анализов.

Выделение РНК: Экстракция РНК из плазмы: размороженные образцы плазмы центрифугировали, и супернатант плазмы (200 мкл) использовали для очистки тотальной РНК, включая малые РНК; Экстракцию РНК проводили с использованием набора miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя.

Экстракция РНК из говядины. Суммарную РНК, включая малые РНК, экстрагировали из сырой и приготовленной говядины с использованием набора miRNeasy Mini Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы 50 мг быстрозамороженной сырой или приготовленной говядины помещали в 700 мкл лизирующего реагента для разрушения и немедленной гомогенизации с использованием гомогенизатора PRO200 (PRO Scientific). РНК элюировали 30 мкл воды, свободной от РНКазы. Количество и чистоту определяли с помощью Nanodrop ND-1000.

Анализ qRT-PCR: Количественное определение микроРНК 1, 10b, 22, 92a и 192 проводили, как показано: 4 мкл общей РНК использовали в качестве матрицы для обратной транскрипции микроРНК. Обратную транскрипцию проводили с использованием универсального набора для синтеза кДНК (Exiqon): 0,5 мкл синтетической микроРНК SPIKE (UniSp6) добавляли к каждому образцу для нормализации уровней микроРНК в плазме. КПЦР в реальном времени проводили с использованием ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix и праймеров miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR (Exiqon) для hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22. -3p, hsa-miR-192-5p и hsa-miR-92a-3p. Программу ПЦР и анализ кривой диссоциации проводили в термоциклере LightCycler Nano (Roche) в условиях, описанных производителем.

Был подтвержден метод относительного количественного определения, и количественное определение миРНК в группе всеядных животных было проведено с использованием метода 2-ΔΔCt, в качестве нормализатора использовалась спайка в UniSp6, а в качестве калибратора использовалось среднее значение ΔCt контрольной группы в каждый момент времени (0 , 2, 4 и 6 часов). Всплеск в UniSp6 использовался в качестве нормализатора из-за отсутствия эндогенных контролей, установленных для нормализации в образцах сыворотки и плазмы. Каждый образец анализировали в трех экземплярах, включая добавление в UniSp6 и отрицательный контроль. Были получены данные по количественному обнаружению микроРНК в плазме после приема пищи с говядиной по сравнению с контрольной группой (веганская еда).

Анализ данных. Нормальное распределение микроРНК определяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Описательную статистику проводили со значениями 2-ΔΔCt обеих исследуемых групп в каждое время сбора (0, 2, 4 и 6 ч). Дифференциальное обнаружение миРНК между всеядными и контрольной группой оценивали с помощью t-критерия Стьюдента в разные моменты времени после приема пищи и сравнивали с обнаружением натощак с использованием теста ANOVA. Корреляции Пирсона были выполнены, чтобы связать уровни микроРНК с контрольной или всеядной диетой. Анализ проводился с использованием IBM SPSS Statistics 20, и различия считались значимыми, если p < 0,05.