Búsqueda de transferencia de miARN bovino a humanos

La dieta juega un papel importante tanto en los procesos de salud como de enfermedad; el estudio de la influencia de la dieta en la expresión y regulación de genes permitirá una mayor comprensión de la relación entre dieta y salud. Uno de los mecanismos de regulación génica más estudiados en la actualidad es el de los microRNAs (miRNAs). Los miARN son pequeños ARN no codificantes (aproximadamente ~22 nucleótidos) que regulan la expresión génica a nivel postranscripcional e influyen en procesos como el desarrollo, la homeostasis, la respuesta inmunitaria, el metabolismo y los procesos epigenéticos. Los miARN se unen a secuencias específicas en los transcritos de ARNm objetivo para reprimir la traducción o inducir la degradación del ARNm. Los miARN están presentes de forma estable en diferentes biofluidos y algunos pueden ser absorbidos directamente por las células receptoras para controlar la expresión génica y las funciones celulares.

La transferencia de ARN exógeno funcional se ha demostrado en infecciones bacterianas y virales, pero está menos caracterizada en mamíferos. Los alimentos derivados de plantas y animales contienen miARN y algunos informes han detectado miARN derivados de la dieta que circulan en el suero de los mamíferos. Estos hallazgos respaldan la transferencia entre reinos de miARN específicos al tejido de los mamíferos después del consumo de alimentos. Sin embargo, aún no está claro si los miARN presentes en los alimentos derivados de plantas y animales pueden ser absorbidos por el tracto gastrointestinal y llevados a los tejidos para realizar funciones reguladoras para la regulación cruzada de la expresión génica entre especies. La entrega de miARN funcionales de fuentes derivadas de la dieta a través de la barrera gastrointestinal podría ser relevante para la nutrición, la agricultura, la salud humana y podría tener muchas aplicaciones potenciales en la orientación terapéutica. A la luz de los hallazgos controvertidos sobre los miARN derivados de la dieta, la pregunta debe examinarse para determinar la transferencia de miARN exógeno funcional en mamíferos. Los investigadores estudiaron la posible transferencia de miRNAs derivados de la dieta del tejido animal al plasma humano porque la carne de res es un componente importante de la dieta en el noreste de México y su consumo se ha asociado como un factor de riesgo potencial para diferentes patologías, incluido el cáncer colorrectal.

Métodos Participantes del estudio: El protocolo fue aprobado por un comité ético. Treinta voluntarios, quince omnívoros y quince veganos (grupo de control), se inscribieron en el estudio. Un sujeto omnívoro no completó la prueba. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la inscripción en el estudio. Para verificar el estado de salud de los participantes se realizaron medidas antropométricas, biometría hemática y bioquímica sérica.

Criterios de inclusión y exclusión: Se reclutaron voluntarios sanos de 18 a 30 años de edad, capaces de otorgar consentimiento informado, con similares características antropométricas. Los participantes se dividieron en dos grupos: omnívoros y veganos (control). El criterio de inclusión para los sujetos omnívoros fue que deberían consumir carne de res al menos tres veces por semana. El criterio de inclusión para los sujetos veganos fue que deberían haber seguido una dieta vegana estricta durante al menos un año. Los criterios de exclusión para todos los sujetos incluyeron embarazo, menstruación durante la recolección de la muestra del estudio, uso de medicamentos o complementos alimenticios, malabsorción intestinal e intolerancia a los ingredientes incluidos en la intervención dietética.

Procedimiento del estudio: Las muestras de sangre de referencia se obtuvieron después de 12 horas de ayuno nocturno; el estado de miARN posprandial se midió tras la ingesta de una comida con carne de vacuno (comida de prueba) que consistía en 200 g de rosbif con ensalada (lechuga, tomate, lentejas) y una taza de arroz. La dieta control consistió en la misma intervención, sin el rosbif. Cada día de intervención las comidas se prepararon con alimentos frescos. Los participantes comieron bajo el control del personal del estudio. Se recogieron muestras posprandiales a las 2, 4 y 6 horas después de la intervención dietética. Los sujetos no volvieron a comer ni beber hasta el final de la recogida de muestras.

Se recogieron muestras de sangre de plasma humano en tubos de vacío que contenían EDTA; Se recogieron aproximadamente 5 ml de sangre de acuerdo con los procedimientos estándar en cada punto de tiempo (0, 2, 4 y 6 horas). El plasma se separó por centrifugación durante 15 minutos a 2000 × g a temperatura ambiente, seguido de congelación a -80 °C hasta que se realizaron los análisis.

Aislamiento de ARN: Extracción de ARN de plasma: las muestras de plasma descongelado se centrifugaron y se usó sobrenadante de plasma (200 µl) para purificar el ARN total, incluidos los ARN pequeños; La extracción de ARN se llevó a cabo utilizando el kit miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Extracción de ARN de carne de vacuno: el ARN total, incluidos los ARN pequeños, se extrajo de la carne de vacuno cruda y cocida utilizando el minikit miRNeasy (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Muestras de 50 mg de carne de res cruda o cocida ultracongelada se colocaron en 700 µl de reactivo de lisis para su disgregación y homogeneización inmediatamente utilizando el homogeneizador PRO200 (PRO Scientific). El ARN se eluyó en 30 µl de agua libre de ARNasa. La cantidad y la pureza se determinaron usando un Nanodrop ND-1000.

Ensayo qRT-PCR: la cuantificación de los miARN 1, 10b, 22, 92a y 192 se realizó como se muestra: se usaron 4 µl de ARN total como plantilla para la transcripción inversa de miARN. La transcripción inversa se realizó con el kit de síntesis Universal cDNA, (Exiqon): se agregaron 0,5 µL de miRNA sintético SPIKE (UniSp6) a cada muestra para la normalización de los niveles plasmáticos de miRNA. La qPCR en tiempo real se realizó con ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix y cebadores miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, (Exiqon) para hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22 -3p, hsa-miR-192-5p y hsa-miR-92a-3p. El programa de PCR y el análisis de la curva de disociación se realizaron en un termociclador LightCycler Nano (Roche) en las condiciones descritas por el fabricante.

Se validó el método de cuantificación relativa y la cuantificación de miARN en el grupo omnívoro se realizó mediante el método 2-ΔΔCt, el normalizador utilizado fue el Spike en UniSp6 y el calibrador fue el valor medio ΔCt del grupo control en cada punto de tiempo (0 , 2, 4 y 6 horas). Spike en UniSp6 se utilizó como normalizador debido a la falta de controles endógenos establecidos para la normalización en muestras de suero y plasma. Cada muestra se analizó por triplicado incluyendo el Spike en UniSp6 y los controles negativos. Se obtuvieron datos para la detección cuantitativa de miARN en plasma después de una comida con carne de res en comparación con el grupo de control (comida vegana).

Análisis de datos: La distribución normal de los miARN se determinó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Se realizaron estadísticas descriptivas con los valores de 2-ΔΔCt de ambos grupos de estudio en cada momento de recolección (0, 2, 4 y 6 h). La detección diferencial de miARN entre el omnívoro y el grupo de control se evaluó mediante la prueba t-student en diferentes puntos de tiempo posprandiales y se comparó con la detección en ayunas mediante la prueba ANOVA. Se realizaron correlaciones de Pearson para asociar los niveles de miRNAs con una dieta control u omnívora. El análisis se hizo con el uso de IBM SPSS Statistics 20 y las diferencias se consideraron significativas si p <0,05.