Søg efter Bovine miRNA Transference to Humans

Kosten spiller en vigtig rolle i både sundheds- og sygdomsprocesser; undersøgelsen af ​​kostens indflydelse på ekspression og regulering af gener vil give en større forståelse af sammenhængen mellem kost og sundhed. En af de mest undersøgte genreguleringsmekanismer på nuværende tidspunkt er mikroRNA'er (miRNA'er). miRNA'er er små ikke-kodende RNA (ca. ~22 nukleotider), der regulerer genekspression på post-transkriptionelt niveau og påvirker processer såsom udvikling, homeostase, immunrespons, metabolisme og epigenetiske processer. miRNA'er binder til specifikke sekvenser i mål-mRNA-transkripter for at undertrykke translation eller inducere mRNA-nedbrydning. miRNA'er er stabilt til stede i forskellige biovæsker, og nogle kan optages direkte af modtagerceller til kontrol af genekspression og cellulære funktioner.

Overførslen af ​​funktionelt eksogent RNA er blevet påvist i bakterielle og virale infektioner, men det er mindre godt karakteriseret hos pattedyr. Fødevarer afledt af planter og dyr indeholder miRNA'er, og nogle rapporter har påvist diæt-afledte miRNA'er, der cirkulerer i pattedyrserum. Disse fund understøtter overførsel på tværs af riget af specifikke miRNA'er til pattedyrsvæv efter fødeindtagelse. Det er dog stadig uklart, om miRNA'er, der er til stede i fødevarer afledt af planter og dyr, kan absorberes af mave-tarmkanalen og bringes til vævene for at udføre regulatoriske funktioner til krydsregulering af genekspression mellem arter. Levering af funktionelle miRNA'er fra diæt-afledte kilder på tværs af den gastrointestinale barriere kan være relevant for ernæring, landbrug, menneskers sundhed og kan have mange potentielle anvendelser i terapeutisk målretning. I lyset af de kontroversielle resultater om diæt-afledte miRNA'er, skal spørgsmålet undersøges for at bestemme overførslen af ​​funktionelt eksogent miRNA i pattedyr. Efterforskerne undersøgte den mulige overførsel af diætafledte miRNA'er fra animalsk væv til humant plasma, fordi oksekød er en vigtig diætkomponent i det nordøstlige Mexico, og dets forbrug er blevet forbundet som en potentiel risikofaktor for forskellige patologier, herunder kolorektal cancer.

Metoder Undersøgelsesdeltagere: Protokollen blev godkendt af en etisk komité. Tredive frivillige, femten altædende og femten veganere (kontrolgruppe), blev tilmeldt undersøgelsen. Ét altædende forsøgsperson fuldførte ikke forsøget. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle deltagere før tilmelding til undersøgelsen. For at verificere deltagernes helbredsstatus blev der udført antropometriske mål, hæmatisk biometri og serumkemi.

Inklusions- og eksklusionskriterier: Raske frivillige i alderen 18 til 30 år, i stand til at give informeret samtykke, med lignende antropometriske karakteristika blev rekrutteret. Deltagerne blev opdelt i to grupper: altædende og vegansk (kontrol). Inklusionskriterier for altædende forsøgspersoner var, at de skulle indtage oksekød mindst tre gange om ugen. Inklusionskriterierne for veganske forsøgspersoner var, at de skulle have fulgt en streng vegansk diæt i mindst et år. Eksklusionskriterier for alle forsøgspersoner omfattede graviditet, menstruation under prøveindsamling, brug af medicin eller kosttilskud, tarmmalabsorption og intolerance over for ingredienser inkluderet i diætinterventionen.

Undersøgelsesprocedure: Baseline-blodprøver blev taget efter 12 timers faste natten over; den postprandiale miRNA-tilstand blev målt efter indtagelse af et måltid med oksekød (testmåltid), der bestod af 200 g roastbeef med salat (salat, tomat, linser) og en kop ris. Kontroldiæten bestod af samme indgreb uden roastbeef. Hver interventionsdag blev måltiderne tilberedt med frisk mad. Deltagerne spiste måltider under kontrol af undersøgelsens personale. Postprandiale prøver blev indsamlet 2, 4 og 6 timer efter diætinterventionen. Forsøgspersonerne spiste eller drak ikke igen før slutningen af ​​prøveindsamlingen.

Humane plasmablodprøver blev opsamlet i vakuumrør indeholdende EDTA; ca. 5 ml blod blev opsamlet ifølge standardprocedurer på hvert tidspunkt (0, 2, 4 og 6 timer). Plasma blev adskilt ved centrifugering i 15 minutter ved 2.000 x g ved stuetemperatur efterfulgt af frysning ved -80 °C, indtil analyser blev udført.

RNA-isolering: Plasma-RNA-ekstraktion: optøede plasmaprøver blev centrifugeret, og plasmasupernatant (200 µL) blev anvendt til oprensning af totalt RNA inklusive små RNA'er; RNA-ekstraktion blev udført ved hjælp af miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) i henhold til producentens instruktioner.

Oksekød-RNA-ekstraktion: Total RNA inklusive små RNA'er blev ekstraheret fra råt og kogt oksekød ved hjælp af miRNeasy Mini Kit (Qiagen) efter producentens instruktioner. Prøver af 50 mg lynfrosset rå eller kogt oksekød blev anbragt i 700 µL lyseringsreagens til afbrydelse og homogenisering med det samme ved hjælp af PR0200-homogenisatoren (PRO Scientific). RNA'et blev elueret i 30 µl RNase-frit vand. Mængde og renhed blev bestemt under anvendelse af en Nanodrop ND-1000.

qRT-PCR-assay: Kvantificeringen af ​​miRNA'erne 1, 10b, 22, 92a og 192 blev udført som vist: 4 µL totalt RNA blev brugt som skabelon for miRNA revers transkription. Omvendt transkription blev udført ved hjælp af Universal cDNA-syntesesættet, (Exiqon): 0,5 µL syntetisk miRNA SPIKE (UniSp6) blev tilsat til hver prøve til normalisering af miRNA-plasmaniveauer. Real-time qPCR blev udført ved at bruge ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix og primere miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, (Exiqon) for hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22 -3p, hsa-miR-192-5p og hsa-miR-92a-3p. PCR-programmet og dissociationskurveanalysen blev udført i en LightCycler Nano termisk cyklus (Roche) under de betingelser, der er beskrevet af producenten.

Den relative kvantificeringsmetode blev valideret, og miRNA-kvantificeringen i omnivore-gruppen blev udført ved hjælp af metoden 2-ΔΔCt, den anvendte normalisator var Spike i UniSp6, og kalibratoren var den gennemsnitlige værdi ΔCt for kontrolgruppen på hvert tidspunkt (0) 2, 4 og 6 timer). Spike i UniSp6 blev brugt som normalisator på grund af manglen på endogene kontroller etableret til normalisering i serum- og plasmaprøver. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer inklusive spidsen i UniSp6 og de negative kontroller. Data blev indhentet data for den kvantitative miRNA-detektion i plasma efter et måltid med oksekød sammenlignet med kontrolgruppen (vegansk måltid).

Dataanalyse: miRNAs normalfordeling blev bestemt ved Kolmogorov-Smirnov-testen. Beskrivende statistik blev udført med 2-ΔΔCt-værdierne for begge undersøgelsesgrupper ved hvert indsamlingstidspunkt (0, 2, 4 og 6 timer). miRNAs differentiel påvisning mellem omnivoren og kontrolgruppen blev evalueret ved t-student test på forskellige postprandiale tidspunkter blev sammenlignet med fastende påvisning ved hjælp af ANOVA testen. Pearson-korrelationer blev udført for at associere miRNA-niveauerne med en kontrol- eller altædende diæt. Analysen blev udført ved brug af IBM SPSS Statistics 20, og forskelle blev betragtet som signifikante, hvis p <0,05.