Zoek naar Bovine miRNA-overdracht naar mensen

Dieet speelt een belangrijke rol in zowel gezondheids- als ziekteprocessen; de studie van de invloed van voeding op de expressie en regulatie van genen zal leiden tot een beter begrip van de relatie tussen voeding en gezondheid. Een van de meest bestudeerde genregulatiemechanismen op dit moment is dat van microRNA's (miRNA's). miRNA's zijn kleine niet-coderende RNA's (ongeveer ~ 22 nucleotiden) die genexpressie reguleren op post-transcriptioneel niveau en processen beïnvloeden zoals ontwikkeling, homeostase, immuunrespons, metabolisme en epigenetische processen. miRNA's binden aan specifieke sequenties in doelwit-mRNA-transcripten om translatie te onderdrukken of mRNA-afbraak te induceren. miRNA's zijn stabiel aanwezig in verschillende biovloeistoffen en sommige kunnen direct worden opgenomen door ontvangende cellen voor controle van genexpressie en cellulaire functies.

De overdracht van functioneel exogeen RNA is aangetoond bij bacteriële en virale infecties, maar is minder goed gekarakteriseerd bij zoogdieren. Voedingsmiddelen afkomstig van planten en dieren bevatten miRNA's, en in sommige rapporten zijn miRNA's afkomstig van voeding gedetecteerd die in zoogdierserum circuleren. Deze bevindingen ondersteunen de overdracht van specifieke miRNA's naar zoogdierweefsel na voedselconsumptie. Het is echter nog steeds onduidelijk of miRNA's die aanwezig zijn in voedsel afkomstig van planten en dieren kunnen worden opgenomen door het maagdarmkanaal en naar de weefsels kunnen worden gebracht om regulerende functies uit te voeren voor de kruisregulering van genexpressie tussen soorten. Het leveren van functionele miRNA's uit voedingsbronnen over de gastro-intestinale barrière kan relevant zijn voor voeding, landbouw, menselijke gezondheid en kan veel potentiële toepassingen hebben bij therapeutische targeting. In het licht van de controversiële bevindingen over van voeding afgeleide miRNA's, moet de vraag worden onderzocht om de overdracht van functioneel exogeen miRNA bij zoogdieren te bepalen. De onderzoekers bestudeerden de mogelijke overdracht van uit voeding afkomstige miRNA's van dierlijk weefsel naar menselijk plasma, omdat rundvlees een belangrijke voedingscomponent is in Noordoost-Mexico en de consumptie ervan in verband wordt gebracht als een potentiële risicofactor voor verschillende pathologieën, waaronder colorectale kanker.

Methoden Deelnemers aan de studie: Het protocol werd goedgekeurd door een ethische commissie. Dertig vrijwilligers, vijftien omnivoren en vijftien veganisten (controlegroep), namen deel aan het onderzoek. Eén omnivoor proefpersoon voltooide de proef niet. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers voorafgaand aan inschrijving in het onderzoek. Om de gezondheidstoestand van de deelnemers te verifiëren, werden antropometrische metingen, hematische biometrie en serumchemie uitgevoerd.

In- en uitsluitingscriteria: gezonde vrijwilligers van 18 tot 30 jaar oud, in staat om geïnformeerde toestemming te geven, met vergelijkbare antropometrische kenmerken werden aangeworven. De deelnemers werden verdeeld in twee groepen: omnivoren en veganisten (controle). Inclusiecriterium voor omnivore proefpersonen was dat ze minstens drie keer per week rundvlees moesten eten. Het inclusiecriterium voor veganistische proefpersonen was dat ze minimaal een jaar een strikt veganistisch dieet hadden moeten volgen. Uitsluitingscriteria voor alle proefpersonen waren onder meer zwangerschap, menstruatie tijdens het verzamelen van onderzoeksmonsters, gebruik van medicijnen of voedingssupplementen, intestinale malabsorptie en intolerantie voor ingrediënten die in de dieetinterventie waren opgenomen.

Studieprocedure: Baseline bloedmonsters werden verkregen na 12 uur 's nachts vasten; de postprandiale miRNA-toestand werd gemeten na inname van een maaltijd met rundvlees (testmaaltijd) die bestond uit 200 g rosbief met salade (sla, tomaat, linzen) en een bakje rijst. Het controledieet bestond uit dezelfde ingreep, maar dan zonder de rosbief. Elke interventiedag werden de maaltijden bereid met vers voedsel. Deelnemers aten maaltijden onder controle van het studiepersoneel. Postprandiale monsters werden 2, 4 en 6 uur na de dieetinterventie verzameld. De proefpersonen aten of dronken niet meer tot het einde van de monsterafname.

Bloedmonsters van menselijk plasma werden verzameld in vacuümbuizen die EDTA bevatten; ongeveer 5 ml bloed werd verzameld volgens standaardprocedures op elk tijdstip (0, 2, 4 en 6 uur). Plasma werd gescheiden door gedurende 15 minuten te centrifugeren bij 2.000 x g bij kamertemperatuur, gevolgd door bevriezen bij -80 °C totdat analyses waren uitgevoerd.

RNA-isolatie: plasma-RNA-extractie: ontdooide plasmamonsters werden gecentrifugeerd en plasmasupernatant (200 µl) werd gebruikt voor het zuiveren van totaal RNA inclusief kleine RNA's; RNA-extractie werd uitgevoerd met behulp van de miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) volgens de instructies van de fabrikant.

Rundvlees-RNA-extractie: totaal RNA inclusief kleine RNA's werd geëxtraheerd uit rauw en gekookt rundvlees met behulp van miRNeasy Mini Kit (Qiagen) volgens de instructies van de fabrikant. Monsters van 50 mg snelgevroren rauw of gekookt rundvlees werden in 700 µl lysisreagens geplaatst voor verstoring en homogenisatie, onmiddellijk met behulp van de PRO200-homogenisator (PRO Scientific). Het RNA werd geëlueerd in 30 µl RNase-vrij water. Hoeveelheid en zuiverheid werden bepaald met behulp van een Nanodrop ND-1000.

qRT-PCR-assay: de kwantificering van de miRNA's 1, 10b, 22, 92a en 192 werd uitgevoerd zoals getoond: 4 µL totaal RNA werd gebruikt als sjabloon voor miRNA reverse transcriptie. Omgekeerde transcriptie werd uitgevoerd met behulp van de Universal cDNA-synthesekit (Exiqon): 0,5 μL synthetisch miRNA SPIKE (UniSp6) werd aan elk monster toegevoegd voor normalisatie van miRNA-plasmaspiegels. Realtime qPCR werd uitgevoerd met behulp van de ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix en primers miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, (Exiqon) voor hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22 -3p, hsa-miR-192-5p en hsa-miR-92a-3p. Het PCR-programma en de analyse van de dissociatiecurve werden uitgevoerd in een LightCycler Nano thermal cycler (Roche) onder de door de fabrikant beschreven omstandigheden.

De relatieve kwantificatiemethode werd gevalideerd en de miRNA-kwantificering in de omnivoorgroep werd uitgevoerd met behulp van de methode 2-ΔΔCt, de gebruikte normalizer was de Spike in UniSp6 en de kalibrator was de gemiddelde waarde ΔCt van de controlegroep op elk tijdstip (0 , 2, 4 en 6 uur). Spike in UniSp6 werd gebruikt als normalisator vanwege het ontbreken van endogene controles die zijn vastgesteld voor normalisatie in serum- en plasmamonsters. Elk monster werd in drievoud geanalyseerd, inclusief de Spike in UniSp6 en de negatieve controles. Er werden gegevens verkregen voor de kwantitatieve detectie van miRNA in plasma na een maaltijd met rundvlees in vergelijking met de controlegroep (veganistische maaltijd).

Gegevensanalyse: de normale verdeling van de miRNA's werd bepaald door de Kolmogorov-Smirnov-test. Beschrijvende statistieken werden uitgevoerd met de 2-ΔΔCt-waarden van beide studiegroepen op elk verzamelmoment (0, 2, 4 en 6 uur). miRNA's differentiële detectie tussen de omnivoor en de controlegroep werd geëvalueerd door t-student-test op verschillende postprandiale tijdstippen en werd vergeleken met nuchtere detectie met behulp van de ANOVA-test. Er werden Pearson-correlaties uitgevoerd om de miRNA-niveaus te associëren met een controle- of omnivoor dieet. De analyse is uitgevoerd met behulp van IBM SPSS Statistics 20 en verschillen werden als significant beschouwd als p <0,05.