Pesquisar transferência de miRNA bovino para humanos

A dieta desempenha um papel importante nos processos de saúde e doença; o estudo da influência da dieta na expressão e regulação dos genes permitirá uma maior compreensão da relação entre alimentação e saúde. Um dos mecanismos de regulação gênica mais estudados atualmente é o dos microRNAs (miRNAs). miRNAs são pequenos RNA não codificantes (aproximadamente ~22 nucleotídeos) que regulam a expressão gênica no nível pós-transcricional e influenciam processos como desenvolvimento, homeostase, resposta imune, metabolismo e processos epigenéticos. Os miRNAs se ligam a sequências específicas nos transcritos de mRNA alvo para reprimir a tradução ou induzir a degradação do mRNA. Os miRNAs estão presentes de forma estável em diferentes biofluidos e alguns podem ser absorvidos diretamente pelas células receptoras para o controle da expressão gênica e das funções celulares.

A transferência de RNA exógeno funcional foi demonstrada em infecções bacterianas e virais, mas é menos bem caracterizada em mamíferos. Alimentos derivados de plantas e animais contêm miRNAs e alguns relatos detectaram miRNAs derivados da dieta circulando no soro de mamíferos. Essas descobertas suportam a transferência entre reinos de miRNAs específicos para tecidos de mamíferos após o consumo de alimentos. No entanto, ainda não está claro se os miRNAs presentes em alimentos derivados de plantas e animais podem ser absorvidos pelo trato gastrointestinal e levados aos tecidos para desempenhar funções regulatórias para a regulação cruzada da expressão gênica entre as espécies. A entrega de miRNAs funcionais de fontes derivadas da dieta através da barreira gastrointestinal pode ser relevante para nutrição, agricultura, saúde humana e pode ter muitas aplicações potenciais no direcionamento terapêutico. À luz das descobertas controversas sobre miRNAs derivados da dieta, a questão deve ser examinada para determinar a transferência de miRNA exógeno funcional em mamíferos. Os pesquisadores estudaram a possível transferência de miRNAs derivados da dieta do tecido animal para o plasma humano porque a carne bovina é um importante componente da dieta no nordeste do México e seu consumo foi associado como um fator de risco potencial para diferentes patologias, incluindo câncer colorretal.

Métodos Participantes do estudo: O protocolo foi aprovado por um comitê de ética. Trinta voluntários, quinze onívoros e quinze veganos (grupo controle), foram incluídos no estudo. Um indivíduo onívoro não completou o ensaio. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da inscrição no estudo. Para verificar o estado de saúde dos participantes, foram realizadas medidas antropométricas, biometria hemática e bioquímica sérica.

Critérios de inclusão e exclusão: Foram recrutados voluntários saudáveis ​​com idade entre 18 e 30 anos, aptos a fornecer consentimento informado, com características antropométricas semelhantes. Os participantes foram divididos em dois grupos: onívoros e veganos (controle). O critério de inclusão para indivíduos onívoros foi que eles deveriam consumir carne bovina pelo menos três vezes por semana. O critério de inclusão dos sujeitos veganos foi que eles deveriam ter seguido uma dieta vegana estrita por pelo menos um ano. Os critérios de exclusão para todos os indivíduos incluíram gravidez, menstruação durante a coleta da amostra do estudo, uso de medicamentos ou suplementos alimentares, má absorção intestinal e intolerância aos ingredientes incluídos na intervenção dietética.

Procedimento do estudo: As amostras de sangue da linha de base foram obtidas após 12 horas de jejum noturno; o estado pós-prandial do miRNA foi medido após a ingestão de uma refeição com carne bovina (refeição teste) que consistia em 200 g de rosbife com salada (alface, tomate, lentilhas) e uma xícara de arroz. A dieta controle consistiu na mesma intervenção, sem o rosbife. A cada dia de intervenção as refeições eram preparadas com alimentos frescos. Os participantes comeram as refeições sob o controle da equipe do estudo. Amostras pós-prandiais foram coletadas 2, 4 e 6 horas após a intervenção dietética. Os sujeitos não comeram ou beberam novamente até o final da coleta da amostra.

Amostras de sangue de plasma humano foram coletadas em tubos a vácuo contendo EDTA; aproximadamente 5 mL de sangue foram coletados de acordo com os procedimentos padrão em cada ponto de tempo (0, 2, 4 e 6 horas). O plasma foi separado por centrifugação por 15 minutos a 2.000 × g em temperatura ambiente, seguido de congelamento a -80 °C até que as análises fossem realizadas.

Isolamento de RNAs: Extração de RNA de plasma: amostras de plasma descongeladas foram centrifugadas e o sobrenadante de plasma (200 µL) foi usado para purificação de RNA total, incluindo pequenos RNAs; A extração do RNA foi realizada com o kit miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

Extração de RNA de carne: O RNA total, incluindo pequenos RNAs, foi extraído de carne crua e cozida usando miRNeasy Mini Kit (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. Amostras de 50 mg de carne bovina crua ou cozida congelada rapidamente foram colocadas em 700 µL de reagente de lise para ruptura e homogeneização imediatamente usando o homogeneizador PRO200 (PRO Scientific). O RNA foi eluído em 30 µl de água livre de RNase. A quantidade e a pureza foram determinadas usando um Nanodrop ND-1000.

Ensaio de qRT-PCR: A quantificação dos miRNAs 1, 10b, 22, 92a e 192 foi realizada como mostrado: 4 µL de RNA total foram usados ​​como molde para a transcrição reversa do miRNA. A transcrição reversa foi realizada usando o kit de síntese de cDNA Universal, (Exiqon): 0,5 µL de miRNA sintético SPIKE (UniSp6) foi adicionado a cada amostra para normalização dos níveis plasmáticos de miRNA. A qPCR em tempo real foi realizada usando o ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix e primers miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, (Exiqon) para hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22 -3p, hsa-miR-192-5p e hsa-miR-92a-3p. O programa de PCR e a análise da curva de dissociação foram realizados em um termociclador LightCycler Nano (Roche) nas condições descritas pelo fabricante.

O método de quantificação relativa foi validado e a quantificação de miRNA no grupo onívoro foi realizada pelo método 2-ΔΔCt, o normalizador utilizado foi o Spike em UniSp6 e o ​​calibrador foi o valor médio ΔCt do grupo controle em cada ponto temporal (0 , 2, 4 e 6 horas). Spike em UniSp6 foi usado como normalizador devido à falta de controles endógenos estabelecidos para normalização em amostras de soro e plasma. Cada amostra foi analisada em triplicata, incluindo o Spike em UniSp6 e os controles negativos. Os dados foram obtidos para a detecção quantitativa de miRNA no plasma após uma refeição com carne bovina em comparação com o grupo controle (refeição vegana).

Análise dos dados: A distribuição normal dos miRNAs foi determinada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Estatísticas descritivas foram realizadas com os valores de 2-ΔΔCt de ambos os grupos de estudo em cada tempo de coleta (0, 2, 4 e 6 h). A detecção diferencial de miRNAs entre o grupo onívoro e o grupo controle foi avaliada pelo teste t-student em diferentes momentos pós-prandiais e comparada à detecção em jejum usando o teste ANOVA. Correlações de Pearson foram realizadas para associar os níveis de miRNAs com uma dieta controle ou onívora. A análise foi feita com o uso do IBM SPSS Statistics 20 e as diferenças foram consideradas significativas se p < 0,05.