Recherche de transfert de miARN bovin à l'homme

L'alimentation joue un rôle important dans les processus de santé et de maladie; l'étude de l'influence de l'alimentation sur l'expression et la régulation des gènes permettra de mieux comprendre la relation entre alimentation et santé. L'un des mécanismes de régulation des gènes les plus étudiés à l'heure actuelle est celui des microARN (miARN). Les miARN sont de petits ARN non codants (environ ~ 22 nucléotides) qui régulent l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel et influencent des processus tels que le développement, l'homéostasie, la réponse immunitaire, le métabolisme et les processus épigénétiques. Les miARN se lient à des séquences spécifiques dans les transcrits d'ARNm cibles pour réprimer la traduction ou induire la dégradation de l'ARNm. Les miARN sont présents de manière stable dans différents biofluides et certains peuvent être directement absorbés par les cellules réceptrices pour le contrôle de l'expression des gènes et des fonctions cellulaires.

Le transfert d'ARN exogène fonctionnel a été démontré dans les infections bactériennes et virales mais il est moins bien caractérisé chez les mammifères. Les aliments dérivés de plantes et d'animaux contiennent des miARN et certains rapports ont détecté des miARN dérivés de l'alimentation circulant dans le sérum de mammifères. Ces résultats confirment le transfert inter-royaume de miARN spécifiques aux tissus de mammifères après la consommation de nourriture. Cependant, on ne sait toujours pas si les miARN présents dans les aliments dérivés de plantes et d'animaux peuvent être absorbés par le tractus gastro-intestinal et amenés dans les tissus pour remplir des fonctions régulatrices pour la régulation croisée de l'expression génique entre les espèces. La fourniture de miARN fonctionnels à partir de sources dérivées de l'alimentation à travers la barrière gastro-intestinale pourrait être pertinente pour la nutrition, l'agriculture, la santé humaine et pourrait avoir de nombreuses applications potentielles dans le ciblage thérapeutique. À la lumière des découvertes controversées sur les miARN dérivés de l'alimentation, la question doit être examinée pour déterminer le transfert de miARN exogènes fonctionnels chez les mammifères. Les chercheurs ont étudié le transfert possible de miARN dérivés de l'alimentation des tissus animaux vers le plasma humain, car le bœuf est un élément important de l'alimentation dans le nord-est du Mexique et sa consommation a été associée à un facteur de risque potentiel pour différentes pathologies, notamment le cancer colorectal.

Méthodes Participants à l'étude : Le protocole a été approuvé par un comité d'éthique. Trente volontaires, quinze omnivores et quinze végétaliens (groupe témoin), ont participé à l'étude. Un sujet omnivore n'a pas terminé l'essai. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant leur inscription à l'étude. Pour vérifier l'état de santé des participants, des mesures anthropométriques, une biométrie hématique et une chimie sérique ont été effectuées.

Critères d'inclusion et d'exclusion : Des volontaires sains âgés de 18 à 30 ans, capables de donner un consentement éclairé, avec des caractéristiques anthropométriques similaires ont été recrutés. Les participants ont été divisés en deux groupes : omnivores et végétaliens (contrôle). Les critères d'inclusion pour les sujets omnivores étaient qu'ils devaient consommer du bœuf au moins trois fois par semaine. Le critère d'inclusion des sujets végétaliens était qu'ils devaient avoir suivi un régime végétalien strict pendant au moins un an. Les critères d'exclusion pour tous les sujets comprenaient la grossesse, les menstruations pendant la collecte des échantillons de l'étude, l'utilisation de médicaments ou de compléments alimentaires, la malabsorption intestinale et l'intolérance aux ingrédients inclus dans l'intervention diététique.

Procédure d'étude : des échantillons de sang de base ont été obtenus après 12 heures de jeûne nocturne ; l'état postprandial des miARN a été mesuré après la prise d'un repas à base de bœuf (repas test) composé de 200 g de rosbif accompagné de salade (salade, tomate, lentilles) et d'une tasse de riz. Le régime témoin consistait en la même intervention, sans le rosbif. Chaque jour d'intervention, les repas étaient préparés avec des aliments frais. Les participants ont pris leurs repas sous le contrôle du personnel de l'étude. Des échantillons postprandiaux ont été prélevés 2, 4 et 6 heures après l'intervention diététique. Les sujets n'ont plus mangé ni bu jusqu'à la fin du prélèvement de l'échantillon.

Des échantillons de sang de plasma humain ont été recueillis dans des tubes à vide contenant de l'EDTA ; environ 5 ml de sang ont été prélevés selon les procédures standard à chaque instant (0, 2, 4 et 6 heures). Le plasma a été séparé par centrifugation pendant 15 minutes à 2 000 × g à température ambiante, suivie d'une congélation à -80 °C jusqu'à ce que les analyses soient effectuées.

Isolement des ARN : Extraction de l'ARN plasmatique : les échantillons de plasma décongelés ont été centrifugés et le surnageant plasmatique (200 µL) a été utilisé pour purifier l'ARN total, y compris les petits ARN ; L'extraction de l'ARN a été réalisée à l'aide du kit miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen) selon les instructions du fabricant.

Extraction de l'ARN de bœuf : L'ARN total, y compris les petits ARN, a été extrait de bœuf cru et cuit à l'aide du mini kit miRNeasy (Qiagen) en suivant les instructions du fabricant. Des échantillons de 50 mg de bœuf cru ou cuit surgelé ont été placés dans 700 µL de réactif de lyse pour rupture et homogénéisation immédiate à l'aide de l'homogénéisateur PRO200 (PRO Scientific). L'ARN a été élué dans 30 ul d'eau sans RNase. La quantité et la pureté ont été déterminées à l'aide d'un Nanodrop ND-1000.

Dosage qRT-PCR : La quantification des miARN 1, 10b, 22, 92a et 192 a été réalisée comme indiqué : 4 µL d'ARN total ont été utilisés comme matrice pour la transcription inverse des miARN. La transcription inverse a été réalisée à l'aide du kit de synthèse d'ADNc universel (Exiqon) : 0,5 µL de miARN synthétique SPIKE (UniSp6) ont été ajoutés à chaque échantillon pour la normalisation des taux plasmatiques de miARN. La qPCR en temps réel a été réalisée en utilisant le mélange maître ExiLENT SYBR® Green PCR et les amorces miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, (Exiqon) pour hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22 -3p, hsa-miR-192-5p et hsa-miR-92a-3p. Le programme PCR et l'analyse de la courbe de dissociation ont été réalisés dans un thermocycleur LightCycler Nano (Roche) dans les conditions décrites par le fabricant.

La méthode de quantification relative a été validée et la quantification des miARN dans le groupe omnivore a été réalisée en utilisant la méthode 2-ΔΔCt, le normalisateur utilisé était le Spike en UniSp6 et le calibrateur était la valeur moyenne ΔCt du groupe contrôle à chaque instant (0 , 2, 4 et 6 heures). Spike dans UniSp6 a été utilisé comme normalisateur en raison du manque de contrôles endogènes établis pour la normalisation dans les échantillons de sérum et de plasma. Chaque échantillon a été analysé en triple, y compris le Spike dans UniSp6 et les contrôles négatifs. Les données ont été obtenues pour la détection quantitative des miARN dans le plasma après un repas avec du bœuf par rapport au groupe témoin (repas végétalien).

Analyse des données : La distribution normale des miARN a été déterminée par le test de Kolmogorov-Smirnov. Des statistiques descriptives ont été réalisées avec les valeurs 2-ΔΔCt des deux groupes d'étude à chaque temps de collecte (0, 2, 4 et 6 h). La détection différentielle des miARN entre l'omnivore et le groupe témoin a été évaluée par le test t-student à différents moments postprandiaux et a été comparée à la détection à jeun à l'aide du test ANOVA. Des corrélations de Pearson ont été réalisées pour associer les niveaux de miARN à un régime témoin ou omnivore. L'analyse a été effectuée à l'aide d'IBM SPSS Statistics 20 et les différences ont été considérées comme significatives si p <0,05.