Søk etter Bovine miRNA Transference to Humans

Kosthold spiller en viktig rolle i både helse- og sykdomsprosesser; studiet av kostholdets påvirkning på uttrykk og regulering av gener vil gi en større forståelse av forholdet mellom kosthold og helse. En av de mest studerte genreguleringsmekanismene for tiden er mikroRNA (miRNA). miRNA er små ikke-kodende RNA (omtrent ~22 nukleotider) som regulerer genuttrykk på post-transkripsjonelt nivå og påvirker prosesser som utvikling, homeostase, immunrespons, metabolisme og epigenetiske prosesser. miRNA binder seg til spesifikke sekvenser i mål-mRNA-transkripter for å undertrykke translasjon eller indusere mRNA-nedbrytning. miRNA er stabilt tilstede i forskjellige biovæsker, og noen kan tas opp direkte av mottakerceller for kontroll av genuttrykk og cellulære funksjoner.

Overføring av funksjonelt eksogent RNA er påvist i bakterielle og virusinfeksjoner, men det er mindre godt karakterisert hos pattedyr. Mat fra planter og dyr inneholder miRNA, og noen rapporter har oppdaget diettavledede miRNAer som sirkulerer i pattedyrserum. Disse funnene støtter overføring på tvers av riket av spesifikke miRNA-er til pattedyrvev etter matinntak. Det er imidlertid fortsatt uklart om miRNA-er som finnes i mat fra planter og dyr kan absorberes av mage-tarmkanalen og bringes til vevet for å utføre regulatoriske funksjoner for kryssregulering av genuttrykk mellom arter. Levering av funksjonelle miRNA-er fra diettavledede kilder på tvers av gastrointestinale barrierer kan være relevant for ernæring, landbruk, menneskers helse og kan ha mange potensielle anvendelser i terapeutisk målretting. I lys av de kontroversielle funnene om diettavledede miRNA-er, må spørsmålet undersøkes for å bestemme overføringen av funksjonelt eksogent miRNA hos pattedyr. Etterforskerne studerte mulig overføring av diettavledede miRNA-er fra dyrevev til humant plasma fordi storfekjøtt er en viktig diettkomponent i det nordøstlige Mexico, og forbruket har blitt assosiert som en potensiell risikofaktor for forskjellige patologier, inkludert kolorektal kreft.

Metoder Studiedeltakere: Protokollen ble godkjent av en etisk komité. Tretti frivillige, femten altetende og femten veganere (kontrollgruppe), ble registrert i studien. Én altetende forsøksperson fullførte ikke forsøket. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne før påmelding til studien. For å verifisere helsestatusen til deltakerne ble det utført antropometriske mål, hematisk biometri og serumkjemi.

Inkluderings- og eksklusjonskriterier: Friske frivillige i alderen 18 til 30 år, i stand til å gi informert samtykke, med lignende antropometriske egenskaper ble rekruttert. Deltakerne ble delt inn i to grupper: altetende og vegansk (kontroll). Inklusjonskriterier for altetende personer var at de skulle innta storfekjøtt minst tre ganger i uken. Inklusjonskriteriene for veganske forsøkspersoner var at de skulle ha fulgt et strengt vegansk kosthold i minst ett år. Eksklusjonskriterier for alle forsøkspersoner inkluderte graviditet, menstruasjon under prøvetaking av studien, bruk av medisin eller kosttilskudd, intestinal malabsorpsjon og intoleranse mot ingredienser inkludert i diettintervensjonen.

Studieprosedyre: Baseline blodprøver ble tatt etter 12 timer over natten faste; den postprandiale miRNA-tilstanden ble målt etter inntak av et måltid med biff (testmåltid) som besto av 200 g roastbiff med salat (salat, tomat, linser) og en kopp ris. Kontrolldietten besto av samme intervensjon, uten roastbeef. Hver intervensjonsdag ble måltidene tilberedt med fersk mat. Deltakerne spiste måltider under kontroll av studiepersonalet. Postprandiale prøver ble samlet inn 2, 4 og 6 timer etter diettintervensjonen. Forsøkspersonene spiste eller drakk ikke igjen før slutten av prøveinnsamlingen.

Humane plasmablodprøver ble samlet inn i vakuumrør inneholdende EDTA; ca. 5 ml blod ble samlet i henhold til standardprosedyrer på hvert tidspunkt (0, 2, 4 og 6 timer). Plasma ble separert ved sentrifugering i 15 minutter ved 2000 x g ved romtemperatur etterfulgt av frysing ved -80 °C inntil analyser ble utført.

RNA-isolering: Plasma-RNA-ekstraksjon: tinte plasmaprøver ble sentrifugert og plasmasupernatant (200 µL) ble brukt for å rense totalt RNA inkludert små RNA; RNA-ekstraksjon ble utført ved bruk av miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner.

Ekstraksjon av storfekjøtt RNA: Totalt RNA inkludert små RNA ble ekstrahert fra rå og kokt storfekjøtt ved å bruke miRNeasy Mini Kit (Qiagen) etter produsentens instruksjoner. Prøver av 50 mg hurtigfrosset rå eller kokt storfekjøtt ble plassert i 700 µL lyseringsreagens for avbrudd og homogenisering umiddelbart ved bruk av PRO200-homogenisatoren (PRO Scientific). RNA ble eluert i 30 ul RNase-fritt vann. Mengde og renhet ble bestemt ved bruk av en Nanodrop ND-1000.

qRT-PCR-analyse: Kvantifiseringen av miRNAene 1, 10b, 22, 92a og 192 ble utført som vist: 4 µL totalt RNA ble brukt som mal for miRNA revers transkripsjon. Revers transkripsjon ble utført ved bruk av Universal cDNA-syntesesettet, (Exiqon): 0,5 µL syntetisk miRNA SPIKE (UniSp6) ble tilsatt til hver prøve for normalisering av miRNA-plasmanivåer. Sanntids qPCR ble utført ved å bruke ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix og primere miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, (Exiqon) for hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22 -3p, hsa-miR-192-5p og hsa-miR-92a-3p. PCR-programmet og dissosiasjonskurveanalysen ble utført i en LightCycler Nano termisk syklus (Roche) under betingelsene beskrevet av produsenten.

Den relative kvantifiseringsmetoden ble validert og miRNA-kvantifiseringen i omnivorgruppen ble utført ved bruk av metoden 2-ΔΔCt, normalisatoren som ble brukt var Spike i UniSp6 og kalibratoren var gjennomsnittsverdien ΔCt for kontrollgruppen på hvert tidspunkt (0) 2, 4 og 6 timer). Spike i UniSp6 ble brukt som normalisator på grunn av mangelen på endogene kontroller etablert for normalisering i serum- og plasmaprøver. Hver prøve ble analysert i tre eksemplarer inkludert Spike i UniSp6 og de negative kontrollene. Data ble innhentet data for den kvantitative miRNA-deteksjonen i plasma etter et måltid med storfekjøtt sammenlignet med kontrollgruppen (vegansk måltid).

Dataanalyse: miRNAs normalfordeling ble bestemt ved Kolmogorov-Smirnov-testen. Beskrivende statistikk ble utført med 2-ΔΔCt-verdiene til begge studiegruppene ved hvert innsamlingstidspunkt (0, 2, 4 og 6 timer). miRNAs differensiell deteksjon mellom omnivoren og kontrollgruppen ble evaluert ved t-studenttest på forskjellige postprandiale tidspunkter ble sammenlignet med fastende deteksjon ved bruk av ANOVA-testen. Pearson-korrelasjoner ble utført for å assosiere miRNA-nivåene med en kontroll- eller altetende diett. Analysen ble gjort med bruk av IBM SPSS Statistics 20 og forskjeller ble ansett som signifikante hvis p <0,05.