Szukaj przeniesienia bydlęcego miRNA na ludzi

Dieta odgrywa ważną rolę zarówno w procesach zdrowotnych, jak i chorobowych; badanie wpływu diety na ekspresję i regulację genów pozwoli na lepsze zrozumienie związku między dietą a zdrowiem. Jednym z najlepiej zbadanych obecnie mechanizmów regulacji genów jest mechanizm mikroRNA (miRNA). miRNA to małe niekodujące RNA (około ~22 nukleotydów), które regulują ekspresję genów na poziomie potranskrypcyjnym i wpływają na procesy takie jak rozwój, homeostaza, odpowiedź immunologiczna, metabolizm i procesy epigenetyczne. miRNA wiążą się ze specyficznymi sekwencjami w docelowych transkryptach mRNA, represjonując translację lub indukując degradację mRNA. miRNA są stabilnie obecne w różnych płynach biologicznych, a niektóre mogą być bezpośrednio pobierane przez komórki biorców w celu kontrolowania ekspresji genów i funkcji komórkowych.

Przenoszenie funkcjonalnego egzogennego RNA zostało wykazane w infekcjach bakteryjnych i wirusowych, ale jest gorzej scharakteryzowane u ssaków. Pokarmy pochodzące z roślin i zwierząt zawierają miRNA, a niektóre raporty wykryły miRNA pochodzące z diety krążące w surowicy ssaków. Odkrycia te wspierają przenoszenie specyficznych miRNA między królestwami do tkanek ssaków po spożyciu pokarmu. Jednak nadal nie jest jasne, czy miRNA obecne w żywności pochodzącej z roślin i zwierząt mogą być wchłaniane przez przewód pokarmowy i dostarczane do tkanek, aby pełnić funkcje regulacyjne w zakresie krzyżowej regulacji ekspresji genów między gatunkami. Dostarczanie funkcjonalnych miRNA ze źródeł pochodzących z diety przez barierę żołądkowo-jelitową może mieć znaczenie dla żywienia, rolnictwa, zdrowia ludzi i może mieć wiele potencjalnych zastosowań w ukierunkowaniu terapeutycznym. W świetle kontrowersyjnych ustaleń dotyczących miRNA pochodzących z diety, należy zbadać tę kwestię, aby określić transfer funkcjonalnego egzogennego miRNA u ssaków. Badacze zbadali możliwy transfer miRNA pochodzących z diety z tkanek zwierzęcych do ludzkiego osocza, ponieważ wołowina jest ważnym składnikiem diety w północno-wschodnim Meksyku, a jej spożycie zostało powiązane jako potencjalny czynnik ryzyka różnych patologii, w tym raka jelita grubego.

Metody Uczestnicy badania: Protokół został zatwierdzony przez komisję etyczną. Do badania włączono trzydziestu ochotników, piętnastu wszystkożerców i piętnastu wegan (grupa kontrolna). Jeden wszystkożerny osobnik nie ukończył próby. Pisemną świadomą zgodę uzyskano od wszystkich uczestników przed włączeniem do badania. W celu weryfikacji stanu zdrowia uczestników wykonano pomiary antropometryczne, biometrię hematyczną oraz chemię surowicy.

Kryteria włączenia i wyłączenia: Zrekrutowano zdrowych ochotników w wieku od 18 do 30 lat, zdolnych do wyrażenia świadomej zgody, o podobnych cechach antropometrycznych. Uczestników podzielono na dwie grupy: wszystkożerną i wegańską (kontrolną). Kryteria włączenia dla osób wszystkożernych polegały na tym, że powinni spożywać wołowinę co najmniej trzy razy w tygodniu. Kryteriami włączenia dla wegan było przestrzeganie przez co najmniej rok ścisłej diety wegańskiej. Kryteria wykluczenia dla wszystkich badanych obejmowały ciążę, miesiączkę podczas pobierania próbki do badania, stosowanie leków lub suplementów diety, zespół złego wchłaniania jelitowego oraz nietolerancję składników objętych interwencją dietetyczną.

Procedura badania: Wyjściowe próbki krwi uzyskano po 12 godzinach postu przez noc; poposiłkowy stan miRNA mierzono po spożyciu posiłku z wołowiną (posiłek testowy), który składał się z 200 g rostbefu z surówką (sałata, pomidor, soczewica) i filiżanką ryżu. Dieta kontrolna składała się z tej samej interwencji, bez rostbefu. Każdego dnia interwencji posiłki były przygotowywane ze świeżej żywności. Uczestnicy spożywali posiłki pod kontrolą personelu badawczego. Próbki poposiłkowe pobierano 2, 4 i 6 godzin po interwencji dietetycznej. Badani nie jedli ani nie pili ponownie do końca pobierania próbek.

Próbki krwi ludzkiego osocza zebrano do probówek próżniowych zawierających EDTA; w każdym punkcie czasowym (0, 2, 4 i 6 godzin) pobierano około 5 ml krwi zgodnie ze standardowymi procedurami. Osocze oddzielano przez wirowanie przez 15 minut przy 2000 x gw temperaturze pokojowej, a następnie zamrażano w temperaturze -80°C do czasu wykonania analiz.

Izolacja RNA: Ekstrakcja RNA z osocza: rozmrożone próbki osocza odwirowano i supernatant osocza (200 µl) zastosowano do oczyszczenia całkowitego RNA, w tym małych RNA; Ekstrakcję RNA przeprowadzono przy użyciu zestawu miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta.

Ekstrakcja wołowego RNA: Całkowity RNA, w tym małe RNA, ekstrahowano z surowej i gotowanej wołowiny przy użyciu miRNeasy Mini Kit (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki 50 mg szybko zamrożonej surowej lub gotowanej wołowiny umieszczono w 700 µl odczynnika do lizy w celu natychmiastowego rozbicia i homogenizacji przy użyciu homogenizatora PRO200 (PRO Scientific). RNA eluowano w 30 ul wody wolnej od RNazy. Ilość i czystość określono stosując Nanodrop ND-1000.

Test qRT-PCR: Oznaczenie ilościowe miRNA 1, 10b, 22, 92a i 192 przeprowadzono jak pokazano: 4 ul całkowitego RNA zastosowano jako matrycę do odwrotnej transkrypcji miRNA. Odwrotną transkrypcję przeprowadzono stosując uniwersalny zestaw do syntezy cDNA (Exiqon): 0,5 µl syntetycznego miRNA SPIKE (UniSp6) dodano do każdej próbki w celu normalizacji poziomów miRNA w osoczu. Real-time qPCR przeprowadzono przy użyciu ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix i starterów miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, (Exiqon) dla hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22 -3p, hsa-miR-192-5p i hsa-miR-92a-3p. Program PCR oraz analizę krzywej dysocjacji przeprowadzono w termocyklerze LightCycler Nano (Roche) w warunkach opisanych przez producenta.

Względna metoda oznaczania ilościowego została zwalidowana, a oznaczenie ilościowe miRNA w grupie wszystkożerców przeprowadzono przy użyciu metody 2-ΔΔCt, zastosowanym normalizatorem był Spike w UniSp6, a kalibratorem była średnia wartość ΔCt grupy kontrolnej w każdym punkcie czasowym (0 , 2, 4 i 6 godzin). Spike w UniSp6 zastosowano jako normalizator ze względu na brak endogennych kontroli ustanowionych do normalizacji w próbkach surowicy i osocza. Każdą próbkę analizowano w trzech powtórzeniach, w tym Spike w UniSp6 i kontrole negatywne. Uzyskano dane do ilościowej detekcji miRNA w osoczu po posiłku z wołowiną w porównaniu z grupą kontrolną (posiłek wegański).

Analiza danych: Rozkład normalny miRNA określono za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa. Statystyki opisowe przeprowadzono z wartościami 2-ΔΔCt obu badanych grup w każdym czasie zbierania (0, 2, 4 i 6 godzin). Różnicowe wykrywanie miRNA między wszystkożercą a grupą kontrolną oceniano za pomocą testu t-studenta w różnych punktach czasowych po posiłku i porównywano z wykrywaniem na czczo za pomocą testu ANOVA. Przeprowadzono korelacje Pearsona, aby powiązać poziomy miRNA z dietą kontrolną lub dietą wszystkożerną. Analizę przeprowadzono przy użyciu programu IBM SPSS Statistics 20, a różnice uznano za istotne, jeśli p <0,05.