1型糖尿病患者における間葉系幹細胞

脂肪組織サンプルは、Clementino Fraga Filho (ブラジルのリオデジャネイロ連邦大学の病院) で美容整形手術を受けている 3 人の健康なボランティアの脂肪吸引手順によって取得されます。 ドナーのソロロジーは、梅毒、シャーガス病、B 型肝炎ウイルス、C 型肝炎、HIV 1 および 2、サイトメガロウイルスが陰性でなければなりません。

健康なボランティアから抽出される脂肪組織由来の幹細胞/間質細胞 (ASC) は分離され、培養され、サンプルは Pontifícia Universidade Católica do Paraná の Core Cell Technology で処理されます。 簡単に言えば、手順は次のとおりです。

1. 100mlの脂肪組織を無菌リン酸緩衝生理食塩水(Gibco Invitrogen)で洗浄する。 1 mg/ml コラゲナーゼ タイプ I (Invitrogen) によるワンステップ消化を 37 °C で 30 分間、恒久的に振盪し、続いて 100 μm メッシュ フィルター (BD FALCON、BD Biosciences Discovery Labware、Bedford 、マサチューセッツ州、米国）。 細胞懸濁液を８００ｇで１０分間遠心分離し、赤血球を溶解緩衝液ｐＨ７．３で除去した。
2. 残りの細胞を 400 g で 10 分間洗浄した後、T75 培養フラスコと 10% のウシ胎児血清、ペニシリン (100 単位/ml) およびストレプトマイシン (100 μg/ml)。 培養液は、播種後 3 日後に交換し、その後は 1 週間に 2 回交換します。
3. ASC は、0.5% トリプシン/EDTA (Invitrogen) 溶液で、80% のコンフルエンスに達した後にサブカルチャーになります。 細胞は、増殖のために 4x103 細胞/cm2 の密度で再播種されます11A。
4. 細胞懸濁液の無菌性の品質管理は、細菌および真菌 (Bact / Alert 3D、Biomerieux)、エンドトキシン (Endosafe™ PTS、Charles River)、およびマイコプラズマ (KIT MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection、Lonza) を検出するためのテストによって評価されます。 細胞生存率は、生細胞のパーセンテージを決定するために生体色素 7-AAD (7-アミノアクチノマイシン D - BD#559925) を使用してフローサイトメトリーによって実行され、アネキシン V タンパク質 (BD#51-65875X) で細胞のパーセンテージを決定します。アポトーシス。 GTG-banding法による細胞遺伝学的解析を行います。
5. 細胞は、次のモノクローナル抗体を使用して、臨床応用の前にフローサイトメトリーによって表現型を特徴付けます: FITC 標識 CD14 (BD#555397)、CD45 (BD#555482)、CD19 (BD#555412)、CD44 (BD#555478)。 PE 標識 CD73 (BD#550257)、CD90 (BD#555596)、CD166 (BD#559263)、PerCP 標識 HLA-DR (BD#551375)。 APC 標識 CD34 (BD#555824)、CD105 (BD#562408)、CD29 (BD#559883) はすべて BD (Pharmingen) から購入しました。 少なくとも100.000 イベントは BD FACSCalibur™ フローサイトメーター (BD Biosciences) で取得され、FlowJo 10 (TreeStar) ソフトウェアを使用してデータが分析されます11A。

ASC の抽出、分離、培養、および処理の後、最近発症した 1 型糖尿病患者への注入は、次のようになります。

1. 注入の日に、ASC単層は上記のように解離し、レシピエント患者の1×106細胞/kgが、50%アルブミンおよび5%抗凝固クエン酸デキストロース溶液を含む生理食塩水5mlに再懸濁される。 細胞懸濁液は、リサイクル氷を入れたクーラーに入れて病院に送られます。
2. ASC を受ける患者は、注入当日に入院し、注入の 24 時間後に退院します。 ASC の単回投与は、15 ～ 20 分間、上腕の末梢静脈に注入されます。 患者は、ASC 注入の 1 日後にコレカルシフェロール 2000 UI の経口摂取を開始します。

安全性試験: 有害事象は、入院中 (T0) および各フォローアップ外来受診時 (3 [T3]、6 [T6]、12 [T12]、18 [T18]、および 24 [T24] か月後に記録されます。 ASC 注入)、臨床検査および臨床検査 (血球数、脂質、腎機能および肝機能、甲状腺刺激ホルモン、遊離チロキシン、抗チログロブリン抗体、カルシウム、リン、および 25-ヒドロキシ ビタミン D、自動生化学装置 CMD 800 IX1 で実施) .

臨床的および膵臓機能の評価：参加者は24か月間追跡されます。 初診時、患者様全員に問診と身体検査を行います。 体重、身長、体格指数（BMI）、血圧、心拍数、低血糖の頻度、および体重1kgあたりのインスリン投与量は、最初の来院時（T0）および1回目（T1）、3回目（T3）に評価されます。 6 (T6) 12 (T12)、18 (18)、および 24 (24) か月。

必要に応じて、来院ごとにインスリン用量の調整を行います。 すべての患者は、米国糖尿病協会の推奨に従って栄養指導を受けます。

血液サンプルは、糖化ヘモグロビン (HbA1c. 方法：ボロネート親和性による高速液体クロマトグラフィー）。 0（基礎）、30、60、90、120分の時間を考慮して、液体混合食事（グルセルナ®）の後にCペプチド測定（微粒子化学発光免疫測定法、アーキテクトアボット）によりβ細胞機能を評価します。 曲線下の面積が計算されます。

介入としてビタミンD補給のみを使用した以前の症例対照研究との比較:

研究者は、最近発症した 1 型糖尿病患者と同様の年齢 (> 15 歳) の個人に細胞を注入せずに毎日 2000 UI のビタミン D を投与した場合の効果を調査した症例対照研究に以前に含まれていた患者と私たちの結果を比較します。同じ国の地域 (ブラジル南東部) の別の人口 (サンパウロ)。 したがって、研究者は比較のために 3 つの異なるグループを確立します。1) ASC とビタミン D の補給を受ける患者。 2) ビタミン D 補給のみを受ける予定の患者; 3) 糖尿病の従来の治療を受けるが、追加の実験的治療 (ASC またはビタミン D) を受ける患者。

インスリンの投与量の調整または中止は、血糖コントロールに従って行われます。 HbA1c、C-ペプチド、および体重 1 kg あたりのインスリン投与量の変化をグループ間で比較します。 C-ペプチドは、T0、T6、T12、T18、T24 で免疫蛍光アッセイ (AutoDelfia) によって分析され、混合食事試験 (Glucerna) 後の C-ペプチド刺激の基礎およびピークが考慮されます。