Células-tronco mesenquimais em pacientes com diabetes mellitus tipo 1

Amostras de tecido adiposo serão obtidas através de procedimentos de lipoaspiração de três voluntários saudáveis ​​submetidos a cirurgia estética no Clementino Fraga Filho (hospital da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil). A sorologia do doador deverá ser negativa para sífilis, doença de Chagas, vírus da hepatite B, hepatite C, HIV 1 e 2 e citomegalovírus.

As células-tronco/estromais (ASCs) derivadas do tecido adiposo que serão extraídas em voluntários saudáveis ​​serão isoladas, cultivadas e as amostras serão processadas no Core Cell Technology da Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Resumidamente, os procedimentos são:

1. 100 ml de tecido adiposo serão lavados em solução salina tamponada com fosfato estéril (Gibco Invitrogen). Será realizada uma digestão em uma etapa por 1 mg/ml de colagenase tipo I (Invitrogen) por 30 minutos a 37°C durante agitação permanente, seguida da etapa de filtração através de um filtro de malha de 100 µm (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford , MA, EUA). A suspensão celular será centrifugada a 800 g por 10 minutos, e os eritrócitos foram removidos por tampão de lise, pH 7,3.
2. As células remanescentes serão lavadas a 400 g por 10 minutos e então cultivadas na densidade de 1×105 células/cm2 em frascos de cultura T75 e DMEM-F12 (Gibco Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 unidades /ml) e estreptomicina (100 μg/ml). O meio de cultura será substituído três dias após a semeadura e, a seguir, duas vezes por semana.
3. As ASCs serão subcultivadas após atingir 80% de confluência, com solução de tripsina/EDTA (Invitrogen) 0,5%. As células serão replaqueadas a uma densidade de 4x103 células/cm2 para expansão11A.
4. O controle de qualidade da esterilidade da suspensão celular será avaliado por testes de detecção de bactérias e fungos (Bact/Alert 3D, Biomerieux), endotoxinas (Endosafe™ PTS, Charles River) e Mycoplasma (KIT MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza). A viabilidade celular será realizada por citometria de fluxo utilizando o corante vital 7-AAD (7-Aminoactinomycin D - BD#559925) para determinar a porcentagem de células viáveis ​​e proteína Anexina V (BD#51-65875X) para determinar a porcentagem de células em apoptose. A análise citogenética será realizada pelo método de bandeamento GTG.
5. As células serão caracterizadas fenotipicamente por citometria de fluxo antes da aplicação clínica, utilizando os seguintes anticorpos monoclonais: CD14 marcado com FITC (BD#555397), CD45 (BD#555482), CD19 (BD#555412), CD44 (BD#555478); CD73 marcado com PE (BD#550257), CD90 (BD#555596), CD166 (BD#559263), HLA-DR marcado com PerCP (BD#551375); CD34 marcado com APC (BD#555824), CD105 (BD#562408), CD29 (BD#559883) todos adquiridos da BD (Pharmingen). Pelo menos 100.000 os eventos serão adquiridos em um citômetro de fluxo BD FACSCalibur™ (BD Biosciences) e os dados serão analisados ​​usando o software FlowJo 10 (TreeStar)11A.

Após a extração, isolamento, cultura e processamento das ASCs, a infusão em pacientes com diabetes tipo 1 de início recente será conforme descrito abaixo:

1. No dia da infusão, a monocamada de ASCs será dissociada conforme descrito acima e 1x106 células/kg do paciente receptor será ressuspensa em 5 ml de solução salina com albumina 50% e solução anticoagulante citrato dextrose 5%. A suspensão celular será enviada para o hospital em um refrigerador com gelo reciclado.
2. Os pacientes que receberem ASCs serão admitidos no hospital no dia da infusão e terão alta 24 horas após a infusão. Uma única dose de ASCs será infundida em uma veia periférica do braço durante 15-20 minutos. Os pacientes iniciarão o uso de colecalciferol 2.000 UI via oral um dia após a infusão das ASCs.

Testes de segurança: os eventos adversos serão registrados durante a internação (T0) e a cada consulta ambulatorial de acompanhamento (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] e 24 [T24] meses após a infusão de ASCs), com exames clínicos e laboratoriais (hemograma, lipídios, função renal e hepática, hormônio tireoestimulante, tiroxina livre, anticorpo antitireoglobulina, cálcio, fósforo e 25-hidroxivitamina D, realizados com equipamento bioquímico automatizado CMD 800 IX1) .

Avaliação Clínica e da Função Pancreática: Os participantes serão acompanhados por 24 meses. Na primeira visita, todos os pacientes serão entrevistados e submetidos a um exame físico. Peso, altura, índice de massa corporal (IMC), pressão arterial, frequência cardíaca, frequência de hipoglicemia e dose de insulina/kg de peso corporal serão avaliados na primeira consulta (T0) e após 1 (T1), 3 (T3), 6 (T6) 12 (T12), 18 (18) e 24 (24) meses.

Os ajustes da dose de insulina serão realizados a cada consulta, conforme necessário. Todos os pacientes receberão orientação nutricional de acordo com as recomendações da American Diabetes Association.

Amostras de sangue serão coletadas antes da infusão de ASCs e em T1, T3, T6, T12, T18 e T24 para a medição da hemoglobina glicada (HbA1c. Método: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência por Afinidade com Boronato). A função das células β será avaliada através da medição do Peptídeo C (método de Imunoensaio Quimioluminescente de Micropartículas, Architect Abbott) após uma refeição líquida mista (Glucerna®), considerando o tempo 0 (basal), 30, 60, 90 e 120 minutos. A área sob a curva será calculada.

Comparação com estudo de caso-controle anterior usando apenas suplementação de vitamina D como intervenção:

Os pesquisadores irão comparar nossos resultados com pacientes previamente incluídos em um estudo de caso-controle que investigou os efeitos de 2.000 UI diárias de vitamina D sem a infusão de células em indivíduos com diabetes tipo 1 de início recente e idade semelhante (> 15 anos), de uma população diferente (São Paulo) na mesma região do país (Sudeste brasileiro). Portanto, os pesquisadores estabelecerão três grupos diferentes para comparação: 1) pacientes que receberão suplementação de ASCs + Vitamina D; 2) pacientes que receberão apenas suplementação de vitamina D; 3) pacientes que receberão o tratamento convencional para diabetes, mas qualquer tratamento experimental adicional (ASCs ou Vitamina D).

Os ajustes ou retirada da dose de insulina serão realizados de acordo com o controle glicêmico. Alterações na HbA1c, peptídeo C e dose de insulina/kg de peso corporal serão comparadas entre os grupos. O Peptídeo C será analisado por ensaio imunofluormétrico (AutoDelfia) em T0 e T6 e T12 e T18 e T24, considerando Peptídeo C estimulado basal e pico após teste de refeição mista (Glucerna).