1 型糖尿病患者的间充质干细胞

脂肪组织样本将通过在 Clementino Fraga Filho（巴西里约热内卢联邦大学医院）接受美容手术的三名健康志愿者的吸脂手术获得。 捐助者的生殖学必须对梅毒、南美锥虫病、乙型肝炎病毒、丙型肝炎、HIV 1 和 2 以及巨细胞病毒呈阴性。

从健康志愿者身上提取的脂肪组织来源的干细胞/基质细胞 (ASC) 将在巴拉那天主教大学的核心细胞技术公司进行分离、培养和样品处理。 简而言之，程序是：

1. 100 ml 脂肪组织将在无菌磷酸盐缓冲盐水 (Gibco Invitrogen) 中洗涤。 将在 37°C 下永久摇动期间用 1 mg/ml I 型胶原酶（Invitrogen）进行一步消化 30 分钟，然后通过 100 µm 网状过滤器（BD FALCON，BD Biosciences Discovery Labware，Bedford ，马萨诸塞州，美国）。 将细胞悬浮液以 800 g 离心 10 分钟，并用 pH 7.3 的裂解缓冲液去除红细胞。
2. 将剩余的细胞以 400 g 洗涤 10 分钟，然后在 T75 培养瓶和添加 10% 胎牛血清、青霉素（100 单位）的 DMEM-F12（Gibco Invitrogen）中以 1×105 个细胞/cm2 的密度培养/ml) 和链霉素 (100 μg/ml)。 接种后三天更换培养基，之后每周更换两次。
3. ASCs 将在达到 80% 汇合后使用 0.5% 胰蛋白酶/EDTA (Invitrogen) 溶液进行继代培养。 细胞将以 4x103 个细胞/cm2 的密度重新接种以进行扩增 11A。
4. 细胞悬液无菌的质量控制将通过检测细菌和真菌（Bact / Alert 3D，Biomerieux）、内毒素（Endosafe™ PTS，Charles River）和支原体（KIT MycoAlert™ PLUS 支原体检测，Lonza）的测试进行评估。 细胞活力将通过流式细胞术进行，使用活体染料 7-AAD（7-氨基放线菌素 D - BD#559925）来确定活细胞的百分比，并使用 Annexin V 蛋白（BD#51-65875X）来确定活细胞的百分比细胞凋亡。 细胞遗传学分析将通过 GTG 显带法进行。
5. 在临床应用之前，将使用以下单克隆抗体通过流式细胞术对细胞进行表型表征：FITC 标记的 CD14 (BD#555397)、CD45 (BD#555482)、CD19 (BD#555412)、CD44 (BD#555478)； PE 标记的 CD73 (BD#550257)、CD90 (BD#555596)、CD166 (BD#559263)、PerCP 标记的 HLA-DR (BD#551375)； APC 标记的 CD34 (BD#555824)、CD105 (BD#562408)、CD29 (BD#559883) 均购自 BD (Pharmingen)。 至少 100.000 事件将在 BD FACSCalibur™ 流式细胞仪 (BD Biosciences) 上采集，数据将使用 FlowJo 10 (TreeStar) 软件进行分析11A。

ASCs提取、分离、培养和处理后，新发1型糖尿病患者的输注如下所述：

1. 在输注当天，ASCs 单层将如上所述解离，接受者患者的 1x106 个细胞/kg 将重悬于 5 ml 含 50% 白蛋白和 5% 抗凝剂柠檬酸盐葡萄糖溶液的盐水溶液中。 细胞悬浮液将在装有再生冰的冷却器中送往医院。
2. 将接受 ASCs 的患者将在输注当天入院，并在输注后 24 小时出院。 将在 15-20 分钟内将单剂量的 ASCs 注入上臂外周静脉。 患者将在输注 ASCs 一天后开始口服胆钙化醇 2000 UI。

安全性测试：将在住院期间（T0）和每次门诊随访（3 [T3]、6 [T6]、12 [T12]、18 [T18] 和 24 [T24] 个月后记录不良事件ASCs 输注）、临床和实验室检查（血细胞计数、血脂、肾功能和肝功能、促甲状腺激素、游离酪氨酸、抗甲状腺球蛋白抗体、钙、磷和 25-羟基维生素 D，使用自动化生化设备 CMD 800 IX1 进行） .

临床和胰腺功能评估：参与者将被随访 24 个月。 在第一次访问时，所有患者都将接受采访并进行身体检查。 体重、身高、体重指数（BMI）、血压、心率、低血糖频率和胰岛素剂量/公斤体重将在第一次就诊（T0）和第 1 次（T1）、第 3 次（T3）后进行评估， 6 (T6) 12 (T12) 、18 (18) 和 24 (24) 个月。

必要时每次就诊时都会调整胰岛素剂量。 所有患者都将根据美国糖尿病协会的建议接受营养指导。

在输注 ASCs 之前和 T1、T3、T6、T12、T18 和 T24 时将抽取血样，用于测量糖化血红蛋白 (HbA1c. 方法：通过硼酸盐亲和力的高效液相色谱法）。 在液体混合餐 (Glucerna®) 后，考虑时间 0（基础）、30、60、90 和 120 分钟，将通过 C 肽测量（微粒化学发光免疫测定法，Architect Abbott）评估 β 细胞功能。 将计算曲线下的面积。

与之前仅使用维生素 D 补充剂作为干预措施的病例对照研究的比较：

研究人员将我们的结果与之前纳入一项病例对照研究的患者进行比较，该研究调查了每天 2000 UI 维生素 D 在不输注细胞的情况下对近期发病的 1 型糖尿病和相似年龄（> 15 岁）的个体的影响，从同一国家地区（巴西东南部）的不同人口（圣保罗）。 因此，研究人员将建立三个不同的组进行比较： 1）将接受 ASCs + 维生素 D 补充的患者； 2) 仅接受维生素 D 补充剂的患者； 3) 将接受糖尿病常规治疗但接受任何额外实验性治疗（ASC 或维生素 D）的患者。

将根据血糖控制进行胰岛素剂量调整或停药。 将在组间比较HbA1c、C-肽和胰岛素剂量/kg体重的变化。 C 肽将通过免疫荧光测定法 (AutoDelfia) 在 T0 和 T6 以及 T12 和 T18 和 T24 进行分析，考虑混合膳食测试 (Glucerna) 后的基础和峰值刺激 C 肽。