Células madre mesenquimales en pacientes con diabetes mellitus tipo 1

Se obtendrán muestras de tejido adiposo a través de procedimientos de liposucción de tres voluntarios sanos sometidos a cirugía estética en Clementino Fraga Filho (el hospital de la Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil). La sorología del donante deberá ser negativa para sífilis, enfermedad de Chagas, virus de la hepatitis B, hepatitis C, VIH 1 y 2 y citomegalovirus.

Las células madre/estromales (ASC) derivadas de tejido adiposo que serán extraídas en voluntarios sanos serán aisladas, cultivadas y procesadas en Core Cell Technology de la Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Brevemente, los procedimientos son:

1. Se lavarán 100 ml de tejido adiposo en solución salina tamponada con fosfato estéril (Gibco Invitrogen). Se realizará una digestión de un solo paso con 1 mg/ml de colagenasa tipo I (Invitrogen) durante 30 minutos a 37 °C durante agitación permanente, seguida de un paso de filtración a través de un filtro de malla de 100 µm (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford , MA, EE. UU.). La suspensión celular se centrifugará a 800 g durante 10 minutos, y los eritrocitos se eliminarán mediante tampón de lisis, pH 7,3.
2. El resto de células se lavarán a 400 g durante 10 minutos y luego se cultivarán a una densidad de 1×105 células/cm2 en matraces de cultivo T75 y DMEM-F12 (Gibco Invitrogen) suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina (100 unidades /ml) y estreptomicina (100 μg/ml). El medio de cultivo se repondrá tres días después de la siembra y luego dos veces por semana.
3. Las ASC se subcultivarán después de alcanzar una confluencia del 80 %, con una solución de tripsina/EDTA al 0,5 % (Invitrogen). Las células se volverán a sembrar a una densidad de 4x103 células/cm2 para la expansión11A.
4. El control de calidad de la esterilidad de la suspensión celular se evaluará mediante pruebas para detectar bacterias y hongos (Bact/Alert 3D, Biomerieux), endotoxinas (Endosafe™ PTS, Charles River) y Mycoplasma (KIT MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza). La viabilidad celular se realizará mediante citometría de flujo utilizando el colorante vital 7-AAD (7-Aminoactinomicina D - BD#559925) para determinar el porcentaje de células viables y la proteína Anexina V (BD#51-65875X) para determinar el porcentaje de células en apoptosis. El análisis citogenético se realizará mediante el método de bandas GTG.
5. Las células se caracterizarán fenotípicamente mediante citometría de flujo antes de la aplicación clínica, utilizando los siguientes anticuerpos monoclonales: CD14 marcado con FITC (BD n.° 555397), CD45 (BD n.° 555482), CD19 (BD n.° 555412), CD44 (BD n.° 555478); CD73 marcado con PE (BD n.° 550257), CD90 (BD n.° 555596), CD166 (BD n.° 559263), HLA-DR marcado con PerCP (BD n.° 551375); CD34 (BD n.° 555824), CD105 (BD n.° 562408), CD29 (BD n.° 559883) marcados con APC, todos adquiridos de BD (Pharmingen). Al menos 100.000 los eventos se adquirirán en un citómetro de flujo BD FACSCalibur™ (BD Biosciences) y los datos se analizarán con el software FlowJo 10 (TreeStar)11A.

Después de la extracción, aislamiento, cultivo y procesamiento de las ASC, la infusión en pacientes con diabetes tipo 1 de reciente aparición será de acuerdo con lo que se describe a continuación:

1. El día de la infusión se disociará la monocapa de ASCs como se ha descrito anteriormente y se resuspenderán 1x106 células/kg del paciente receptor en 5 ml de solución salina con albúmina al 50% y solución anticoagulante citrato dextrosa al 5%. La suspensión de células se enviará al hospital en una hielera con hielo reciclado.
2. Los pacientes que recibirán ASC serán ingresados ​​en el hospital el día de la infusión y serán dados de alta 24 horas después de la infusión. Se infundirá una dosis única de ASC en una vena periférica superior del brazo durante 15-20 minutos. Los pacientes comenzarán a tomar 2000 UI de colecalciferol oral un día después de la infusión de ASC.

Pruebas de seguridad: se registrarán los eventos adversos durante la hospitalización (T0) y en cada visita de control ambulatorio (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] y 24 [T24] meses después la infusión de ASCs), con exámenes clínicos y de laboratorio (hemograma, lípidos, función renal y hepática, hormona estimulante de la tiroides, tiroxina libre, anticuerpo antitiroglobulina, calcio, fósforo y 25-Hidroxi vitamina D, realizados con equipo bioquímico automatizado CMD 800 IX1) .

Evaluación clínica y de la función pancreática: se seguirá a los participantes durante 24 meses. En la primera visita, todos los pacientes serán entrevistados y se les realizará un examen físico. Se evaluará peso, talla, índice de masa corporal (IMC), presión arterial, frecuencia cardíaca, frecuencia de hipoglucemias y dosis de insulina/kg de peso corporal en la primera visita (T0) y después de 1 (T1), 3 (T3), 6 (T6) 12 (T12), 18 (18) y 24 (24) meses.

Se realizarán ajustes en la dosis de insulina en cada visita según sea necesario. Todos los pacientes recibirán orientación nutricional de acuerdo con las recomendaciones de la Asociación Estadounidense de Diabetes.

Se extraerán muestras de sangre antes de la infusión de ASC y en T1, T3, T6, T12, T18 y T24 para la medición de la hemoglobina glicosilada (HbA1c. Método: Cromatografía Líquida de Alta Resolución por afinidad al boronato). La función de las células β se evaluará mediante la medición del péptido C (método de inmunoensayo quimioluminiscente de micropartículas, Architect Abbott) después de una comida líquida mixta (Glucerna®), considerando el tiempo 0 (basal), 30, 60, 90 y 120 minutos. Se calculará el área bajo la curva.

Comparación con un estudio previo de casos y controles utilizando solo suplementos de vitamina D como intervención:

Los investigadores compararán nuestros resultados con pacientes incluidos previamente en un estudio de casos y controles que investigó los efectos de 2000 UI diarias de vitamina D sin la infusión de células en individuos con diabetes tipo 1 de inicio reciente y edad similar (> 15 años), desde una población diferente (São Paulo) en la misma región del país (Sudeste brasileño). Por lo tanto, los investigadores establecerán tres grupos diferentes para la comparación: 1) pacientes que recibirán suplementos de ASC + vitamina D; 2) pacientes que recibirán solo suplementos de vitamina D; 3) pacientes que van a recibir el tratamiento convencional para la diabetes pero algún tratamiento experimental adicional (ASCs o Vitamina D).

Los ajustes de la dosis de insulina o la retirada se realizarán de acuerdo con el control glucémico. Los cambios en HbA1c, péptido C y dosis de insulina/kg de peso corporal se compararán entre grupos. El péptido C se analizará mediante ensayo inmunofluorométrico (AutoDelfia) en T0 y T6 y T12 y T18 y T24, considerando el péptido C estimulado basal y pico después de la prueba de comida mixta (Glucerna).