Mesenkymale stamceller hos pasienter med type 1 diabetes mellitus

Fettvevsprøver vil bli tatt gjennom fettsugingsprosedyrer av tre friske frivillige som gjennomgår estetisk kirurgi ved Clementino Fraga Filho (sykehuset ved Federal University of Rio de Janeiro, Brasil). Donors sorologi må være negativ for syfilis, Chagas sykdom, Hepatitt B-virus, Hepatitt C, HIV 1 og 2, og Cytomegalovirus.

De fettvevsavledede stam-/stromalcellene (ASC) som vil bli ekstrakt på friske frivillige vil bli isolert, kultur og prøver vil bli behandlet ved Core Cell Technology i Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Kort fortalt er prosedyrene:

1. 100 ml fettvev skal vaskes i sterilt fosfatbufret saltvann (Gibco Invitrogen). En ett-trinns fordøyelse med 1 mg/ml kollagenase type I (Invitrogen) vil bli utført i 30 minutter ved 37 °C under permanent risting, etterfulgt av filtreringstrinn gjennom et 100 µm mesh-filter (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford , MA, USA). Cellesuspensjonen skal sentrifugeres ved 800 g i 10 minutter, og erytrocytter ble fjernet med lyseringsbuffer, pH 7,3.
2. De resterende cellene skal vaskes ved 400 g i 10 minutter og deretter dyrkes med en tetthet på 1×105 celler/cm2 i T75-kulturkolber og DMEM-F12 (Gibco Invitrogen) tilskudd med 10 % av føtalt kalveserum, penicillin (100 enheter) /ml) og streptomycin (100 μg/ml). Kulturmediet erstattes tre dager etter såing, og deretter to ganger i uken.
3. ASC-er vil være subkultur etter å ha nådd 80% konfluens, med 0,5% trypsin/EDTA (Invitrogen) løsning. Celler vil bli replatet med en tetthet på 4x103 celler/cm2 for ekspansjon11A.
4. Kvalitetskontroll av cellesuspensjonssterilitet vil bli evaluert ved tester for å oppdage bakterier og sopp (Bact / Alert 3D, Biomerieux), endotoksiner (Endosafe ™ PTS, Charles River) og Mycoplasma (KIT MycoAlert ™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza). Cellelevedyktighet vil bli utført ved flowcytometri ved å bruke det vitale fargestoffet 7-AAD (7-Aminoactinomycin D - BD#559925) for å bestemme prosentandelen av levedyktige celler og Annexin V-protein (BD#51-65875X) for å bestemme prosentandelen av celler i apoptose. Cytogenetisk analyse vil bli utført ved GTG-banding-metoden.
5. Celler vil bli fenotypisk karakterisert ved flowcytometri før den kliniske applikasjonen, ved bruk av følgende monoklonale antistoffer: FITC-merket CD14 (BD#555397), CD45 (BD#555482), CD19 (BD#555412), CD44 (BD#555478); PE-merket CD73 (BD#550257), CD90 (BD#555596), CD166 (BD#559263), PerCP-merket HLA-DR (BD#551375); APC-merket CD34 (BD#555824), CD105 (BD#562408), CD29 (BD#559883) alle kjøpt fra BD (Pharmingen). Minst 100.000 hendelser vil bli innhentet på et BD FACSCalibur™ flowcytometer (BD Biosciences), og data vil bli analysert ved hjelp av FlowJo 10 (TreeStar) programvare11A.

Etter ekstraksjon, isolat, kultur og prosess av ASCs vil infusjonen hos pasienter med nylig oppstått type 1-diabetes være som beskrevet nedenfor:

1. På infusjonsdagen vil ASCs monolag dissosieres som beskrevet ovenfor, og 1x106 celler/kg av mottakerpasienten vil bli resuspendert i 5 ml saltvannsoppløsning med 50 % albumin og 5 % antikoagulant citrat dekstroseløsning. Cellesuspensjon vil sendes til sykehuset i en kjøler med resirkulert is.
2. Pasienter som vil motta ASC-er vil bli innlagt på sykehuset på infusjonsdagen og utskrives 24 timer etter infusjon. En enkelt dose ASC-er vil bli infundert i en perifer overarmsvene i løpet av 15-20 minutter. Pasienter vil begynne å ta oral cholecalciferol 2000 UI en dag etter ASCs infusjon.

Sikkerhetstester: bivirkninger vil bli registrert under sykehusinnleggelsen (T0) og ved hvert oppfølgingsbesøk (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] og 24 [T24] måneder etter ASCs infusjon), med kliniske undersøkelser og laboratorieundersøkelser (blodtelling, lipider, nyre- og leverfunksjon, skjoldbruskkjertelstimulerende hormon, fritt tyroksin, antityroglobulinantistoff, kalsium, fosfor og 25-hydroksyvitamin D, utført med automatisert biokjemisk utstyr CMD 800 IX1) .

Klinisk og bukspyttkjertelfunksjonsevaluering: Deltakerne vil bli fulgt i 24 måneder. Ved første besøk vil alle pasienter bli intervjuet og tatt en fysisk undersøkelse. Vekt, høyde, kroppsmasseindeks (BMI), blodtrykk, hjertefrekvens, hyppighet av hypoglykemi og insulindose/kg kroppsvekt vil bli evaluert ved første besøk (T0) og etter 1 (T1), 3 (T3), 6 (T6) 12 (T12), 18 (18) og 24 (24) måneder.

Insulindosejusteringer vil bli utført ved hvert besøk etter behov. Alle pasienter vil motta ernæringsveiledning i henhold til anbefalinger fra American Diabetes Association.

Blodprøver vil bli tatt før ASCs infusjon og ved T1, T3, T6, T12, T18 og T24 for måling av glykert hemoglobin (HbA1c. Metode: Høyytelses væskekromatografi ved boronataffinitet). β-cellefunksjon vil bli evaluert gjennom C-peptidmåling (Microparticle Chemiluminescent Immunoassay method, Architect Abbott) etter et flytende blandet måltid (Glucerna®), tatt i betraktning tiden 0 (basal), 30, 60, 90 og 120 minutter. Arealet under kurven vil bli beregnet.

Sammenligning med tidligere case-kontrollstudie med kun vitamin D-tilskudd som intervensjon:

Etterforskerne vil sammenligne resultatene våre med pasienter som tidligere var inkludert i en case-kontrollstudie som undersøkte effekten av daglig 2000 UI vitamin D uten infusjon av celler hos personer med nylig oppstått type 1 diabetes og lignende alder (> 15 år), fra en annen befolkning (São Paulo) i samme landsregion (Brasiliansk Sørøst). Derfor vil etterforskerne etablere tre forskjellige grupper for sammenligning: 1) pasienter som vil motta ASCs + vitamin D-tilskudd; 2) pasienter som kun vil få vitamin D-tilskudd; 3) pasienter som vil motta den konvensjonelle behandlingen for diabetes, men ytterligere eksperimentell behandling (ASC eller vitamin D).

Insulindosejusteringer eller seponering vil bli utført i henhold til glykemisk kontroll. Endringer i HbA1c, C-peptid og insulindose/kg kroppsvekt vil sammenlignes mellom grupper. C-peptid vil bli analysert ved immunofluorometrisk analyse (AutoDelfia) ved T0 og T6 og T12 og T18 og T24, med tanke på basal- og toppstimulert C-peptid etter blandet måltidstest (Glucerna).