Mesenkymaaliset kantasolut potilailla, joilla on tyypin 1 diabetes mellitus

Rasvakudosnäytteitä otetaan rasvaimulla kolmelta terveeltä vapaaehtoiselta, joille tehdään esteettinen leikkaus Clementino Fraga Filhossa (Rio de Janeiron liittovaltion yliopiston sairaala, Brasilia). Luovuttajien sorologian tulee olla negatiivinen kupan, Chagasin taudin, hepatiitti B -viruksen, hepatiitti C:n, HIV 1 ja 2:n ja sytomegaloviruksen suhteen.

Rasvakudoksesta peräisin olevat kanta-/stromaalisolut (ASC:t), jotka uutetaan terveistä vapaaehtoisista, eristetään, viljely ja näytteet käsitellään Pontifícia Universidade Católica do Paraná -yliopiston Core Cell Technologyssa. Lyhyesti sanottuna menettelyt ovat:

1. 100 ml rasvakudosta pestään steriilissä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (Gibco Invitrogen). Yksivaiheinen pilkkominen 1 mg/ml kollagenaasi tyyppi I:llä (Invitrogen) suoritetaan 30 minuuttia 37 °C:ssa jatkuvan ravistuksen aikana, minkä jälkeen suoritetaan suodatusvaihe 100 µm mesh-suodattimen läpi (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford , MA, USA). Solususpensiota sentrifugoidaan 800 g:ssä 10 minuuttia, ja punasolut poistettiin lyysipuskurilla, pH 7,3.
2. Loput solut pestään 400 g:lla 10 minuuttia ja viljellään sitten tiheydellä 1 × 105 solua/cm2 T75-viljelypulloissa ja DMEM-F12:ta (Gibco Invitrogen) täydennetään 10 %:lla vasikan sikiön seerumia, penisilliiniä (100 yksikköä). /ml) ja streptomysiini (100 µg/ml). Elatusaine vaihdetaan kolmen päivän kuluttua kylvöstä ja sen jälkeen kahdesti viikossa.
3. ASC:t viljellään 80 %:n konfluenssin saavuttamisen jälkeen 0,5 % trypsiini/EDTA (Invitrogen) -liuoksella. Solut kopioidaan uudelleen tiheydellä 4 x 103 solua/cm2 laajentamista varten11A.
4. Solususpension steriiliyden laadunvalvonta arvioidaan testeillä bakteerien ja sienten (Bact / Alert 3D, Biomerieux), endotoksiinien (Endosafe™ PTS, Charles River) ja mykoplasman (KIT MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza) havaitsemiseksi. Solujen elinkelpoisuus määritetään virtaussytometrialla käyttämällä elintärkeää väriainetta 7-AAD (7-aminoaktinomysiini D - BD#559925) elävien solujen prosenttiosuuden määrittämiseksi ja anneksiini V -proteiinin (BD#51-65875X) solujen prosenttiosuuden määrittämiseksi apoptoosi. Sytogeneettinen analyysi suoritetaan GTG-nauhamenetelmällä.
5. Solut karakterisoidaan fenotyyppisesti virtaussytometrialla ennen kliinistä käyttöä käyttämällä seuraavia monoklonaalisia vasta-aineita: FITC-leimattu CD14 (BD#555397), CD45 (BD#555482), CD19 (BD#555412), CD44 (BD#555478); PE-leimattu CD73 (BD#550257), CD90 (BD#555596), CD166 (BD#559263), PerCP-leimattu HLA-DR (BD#551375); APC-leimattu CD34 (BD#555824), CD105 (BD#562408), CD29 (BD#559883) kaikki ostettu BD:ltä (Pharmingen). Vähintään 100 000 tapahtumat kerätään BD FACSCalibur™ -virtaussytometrillä (BD Biosciences), ja tiedot analysoidaan käyttämällä FlowJo 10 (TreeStar) -ohjelmistoa11A.

ASC:iden uuton, isolaatin, viljelyn ja käsittelyn jälkeen infuusio potilailla, joilla on äskettäin alkanut tyypin 1 diabetes, tapahtuu alla kuvatulla tavalla:

1. Infuusiopäivänä yksikerroksiset ASC-solut dissosioituvat edellä kuvatulla tavalla ja 1 x 106 solua/kg vastaanottajapotilasta resuspendoidaan 5 ml:aan suolaliuosta, jossa on 50 % albumiinia ja 5 % antikoagulanttisitraattidekstroosiliuosta. Solususpensio lähetetään sairaalaan jäähdyttimessä, jossa on kierrätettyä jäätä.
2. Potilaat, jotka saavat ASC:tä, viedään sairaalaan infuusiopäivänä ja kotiutetaan 24 tuntia infuusion jälkeen. Yksi ASC-annos infusoidaan perifeeriseen olkavarren laskimoon 15-20 minuutin aikana. Potilaat alkavat ottaa oraalista kolekalsiferoli 2000 UI:ta yksi päivä ASC-infuusion jälkeen.

Turvallisuustestit: haittatapahtumat kirjataan sairaalahoidon aikana (T0) ja jokaisella seurannalla avohoitokäynnillä (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] ja 24 [T24] kuukautta sen jälkeen ASC-infuusio), kliinisillä ja laboratoriotutkimuksilla (verenkuva, lipidit, munuaisten ja maksan toiminta, kilpirauhasta stimuloiva hormoni, vapaa tyroksiini, antityreoglobuliinivasta-aine, kalsium, fosfori ja 25-hydroksi-D-vitamiini, suoritetaan automaattisella biokemiallisella laitteella CMD 800 IX1) .

Kliinisen ja haiman toiminnan arviointi: Osallistujia seurataan 24 kuukauden ajan. Ensimmäisellä käynnillä kaikki potilaat haastatellaan ja heille tehdään fyysinen tarkastus. Paino, pituus, painoindeksi (BMI), verenpaine, sydämen tiheys, hypoglykemian esiintymistiheys ja insuliiniannos painokiloa kohti mitataan ensimmäisellä käynnillä (T0) ja 1 (T1), 3 (T3) jälkeen, 6 (T6) 12 (T12), 18 (18) ja 24 (24) kuukautta.

Insuliiniannosta muutetaan tarvittaessa jokaisella käynnillä. Kaikki potilaat saavat ravitsemusopastusta American Diabetes Associationin suositusten mukaisesti.

Verinäytteet otetaan ennen ASC-infuusiota ja T1, T3, T6, T12, T18 ja T24 Glykoituneen hemoglobiinin (HbA1c) mittaamista varten. Menetelmä: Korkean suorituskyvyn nestekromatografia boronaattiaffiniteetilla). β-solujen toiminta arvioidaan C-peptidimittauksella (Microparticle Chemiluminescent Immunoassay -menetelmä, Architect Abbott) nestemäisen seka-aterian jälkeen (Glucerna®), ottaen huomioon aika 0 (perus), 30, 60, 90 ja 120 minuuttia. Käyrän alla oleva pinta-ala lasketaan.

Vertailu aikaisempaan tapauskontrollitutkimukseen, jossa interventioon käytettiin vain D-vitamiinilisää:

Tutkijat vertaavat tuloksiamme potilaisiin, jotka osallistuivat aiemmin tapauskontrollitutkimukseen, jossa tutkittiin päivittäisen 2000 UI:n D-vitamiinin vaikutuksia ilman solujen infuusiota henkilöillä, joilla on äskettäin alkanut tyypin 1 diabetes ja samanikäiset (> 15 vuotta). eri väestö (São Paulo) samalla maa-alueella (Brasilian kaakkoisosa). Siksi tutkijat perustavat kolme eri ryhmää vertailua varten: 1) potilaat, jotka saavat ASC:itä + D-vitamiinilisää; 2) potilaat, jotka saavat vain D-vitamiinilisää; 3) potilaat, jotka saavat tavanomaista diabeteksen hoitoa mutta mitä tahansa muuta kokeellista hoitoa (ASC:t tai D-vitamiini).

Insuliiniannoksen muuttaminen tai lopettaminen suoritetaan glykeemisen kontrollin mukaisesti. Muutoksia HbA1c:ssä, C-peptidissä ja insuliiniannoksessa/kg ruumiinpainoa verrataan ryhmien välillä. C-peptidi analysoidaan immunofluorometrisellä määrityksellä (AutoDelfia) T0:ssa ja T6:ssa ja T12:ssa ja T18:ssa ja T24:ssä ottaen huomioon perus- ja huippustimuloitu C-peptidi seka-ateriatestin (Glucerna) jälkeen.