Mesenchymale stamcellen bij patiënten met diabetes mellitus type 1

Vetweefselmonsters zullen worden verkregen door middel van liposuctieprocedures van drie gezonde vrijwilligers die esthetische chirurgie ondergaan in Clementino Fraga Filho (het ziekenhuis van de Federale Universiteit van Rio de Janeiro, Brazilië). De sorologie van de donor zal negatief moeten zijn voor syfilis, ziekte van Chagas, hepatitis B-virus, hepatitis C, HIV 1 en 2 en cytomegalovirus.

De van vetweefsel afgeleide stam-/stromale cellen (ASC's) die bij gezonde vrijwilligers worden geëxtraheerd, worden geïsoleerd, gekweekt en monsters worden verwerkt bij Core Cell Technology van Pontifícia Universidade Católica do Paraná. In het kort zijn de procedures:

1. 100 ml vetweefsel wordt gewassen in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (Gibco Invitrogen). Een eenstapsdigestie met 1 mg/ml collagenase type I (Invitrogen) wordt uitgevoerd gedurende 30 minuten bij 37°C tijdens permanent schudden, gevolgd door een filtratiestap door een 100 µm mesh filter (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford , MA, VS). De celsuspensie wordt gedurende 10 minuten bij 800 g gecentrifugeerd en erytrocyten worden verwijderd met lysisbuffer, pH 7,3.
2. De resterende cellen worden gedurende 10 minuten bij 400 g gewassen en vervolgens gekweekt bij een dichtheid van 1 x 105 cellen/cm2 in T75-kweekflessen en DMEM-F12 (Gibco Invitrogen) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, penicilline (100 eenheden /ml) en streptomycine (100 μg/ml). Het kweekmedium wordt drie dagen na het zaaien vervangen en daarna twee keer per week.
3. ASC's zullen subcultuur zijn na het bereiken van 80% confluentie, met 0,5% trypsine/EDTA (Invitrogen) oplossing. Cellen worden herplaat met een dichtheid van 4x103 cellen/cm2 voor expansie11A.
4. De kwaliteitscontrole van de steriliteit van de celsuspensie zal worden geëvalueerd door tests om bacteriën en schimmels (Bact / Alert 3D, Biomerieux), endotoxinen (Endosafe ™ PTS, Charles River) en Mycoplasma (KIT MycoAlert ™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza) te detecteren. De levensvatbaarheid van de cellen zal worden uitgevoerd door middel van flowcytometrie met behulp van de vitale kleurstof 7-AAD (7-Aminoactinomycine D - BD#559925) om het percentage levensvatbare cellen en Annexine V-eiwit (BD#51-65875X) te bepalen om het percentage cellen in apoptose. Cytogenetische analyse zal worden uitgevoerd door GTG-banding methode.
5. Cellen zullen fenotypisch worden gekarakteriseerd door flowcytometrie vóór de klinische toepassing, met behulp van de volgende monoklonale antilichamen: FITC-gelabeld CD14 (BD#555397), CD45 (BD#555482), CD19 (BD#555412), CD44 (BD#555478); PE-gelabeld CD73 (BD#550257), CD90 (BD#555596), CD166 (BD#559263), PerCP-gelabeld HLA-DR (BD#551375); APC-gelabeld CD34 (BD#555824), CD105 (BD#562408), CD29 (BD#559883) allemaal gekocht bij BD (Pharmingen). Minstens 100.000 gebeurtenissen worden geregistreerd op een BD FACSCalibur™ flowcytometer (BD Biosciences) en de gegevens worden geanalyseerd met FlowJo 10 (TreeStar)-software11A.

Na de extractie, het isolement, de kweek en het proces van de ASC's zal de infusie bij patiënten met recent ontstane type 1-diabetes verlopen zoals hieronder beschreven:

1. Op de dag van infusie zal de ASC-monolaag worden gedissocieerd zoals hierboven beschreven en worden 1x106 cellen/kg van de ontvangende patiënt geresuspendeerd in 5 ml zoutoplossing met 50% albumine en 5% antistollingsmiddel citraat-dextrose-oplossing. Celsuspensie wordt naar het ziekenhuis gestuurd in een koelbox met gerecycled ijs.
2. Patiënten die ASC's krijgen, worden op de dag van de infusie in het ziekenhuis opgenomen en worden 24 uur na de infusie ontslagen. Een enkele dosis ASC's wordt gedurende 15-20 minuten in een perifere bovenarmader toegediend. Patiënten beginnen een dag na de ASC-infusie met orale cholecalciferol 2000 UI.

Veiligheidstesten: bijwerkingen worden geregistreerd tijdens de ziekenhuisopname (T0) en bij elk vervolgbezoek aan de polikliniek (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] en 24 [T24] maanden daarna de ASCs-infusie), met klinische en laboratoriumonderzoeken (bloedtelling, lipiden, nier- en leverfunctie, schildklierstimulerend hormoon, vrij tyroxine, antithyroglobuline-antilichaam, calcium, fosfor en 25-Hydroxy Vitamine D, uitgevoerd met geautomatiseerde biochemische apparatuur CMD 800 IX1) .

Klinische en pancreasfunctie-evaluatie: deelnemers worden gedurende 24 maanden gevolgd. Bij het eerste bezoek worden alle patiënten geïnterviewd en lichamelijk onderzocht. Gewicht, lengte, body mass index (BMI), bloeddruk, hartfrequentie, frequentie van hypoglykemie en insulinedosis/kg lichaamsgewicht worden geëvalueerd bij het eerste bezoek (T0) en na 1 (T1), 3 (T3), 6 (T6) 12 (T12), 18 (18) en 24 (24) maanden.

Indien nodig zullen bij elk bezoek aanpassingen van de insulinedosis worden uitgevoerd. Alle patiënten krijgen voedingsadvies volgens de aanbevelingen van de American Diabetes Association.

Bloedmonsters worden afgenomen voorafgaand aan de ASC-infusie en op T1, T3, T6, T12, T18 en T24 voor de meting van het hemoglobineglycaat (HbA1c. Methode: hogedrukvloeistofchromatografie door boronaataffiniteit). De β-celfunctie zal worden geëvalueerd door middel van C-Peptide-meting (Microparticle Chemiluminescent Immunoassay-methode, Architect Abbott) na een vloeibare gemengde maaltijd (Glucerna®), rekening houdend met de tijd 0 (basaal), 30, 60, 90 en 120 minuten. Het gebied onder de curve wordt berekend.

Vergelijking met eerdere case-control studie met alleen vitamine D-suppletie als interventie:

De onderzoekers zullen onze resultaten vergelijken met patiënten die eerder waren opgenomen in een case-control studie die de effecten onderzocht van dagelijkse 2000 UI vitamine D zonder de infusie van cellen bij personen met recent ontstane diabetes type 1 en vergelijkbare leeftijd (> 15 jaar oud), van een andere bevolkingsgroep (São Paulo) in dezelfde landstreek (Braziliaans zuidoosten). Daarom zullen de onderzoekers ter vergelijking drie verschillende groepen opstellen: 1) patiënten die ASC's + vitamine D-suppletie krijgen; 2) patiënten die alleen vitamine D-suppletie krijgen; 3) patiënten die de conventionele behandeling voor diabetes krijgen, maar een aanvullende experimentele behandeling (ASC's of vitamine D).

Aanpassingen of stopzetting van de insulinedosis zullen worden uitgevoerd volgens glykemische controle. Veranderingen in HbA1c, C-Peptide en insulinedosis/kg lichaamsgewicht zullen tussen groepen worden vergeleken. C-Peptide zal worden geanalyseerd door immunofluorometrische assay (AutoDelfia) op T0 en T6 en T12 en T18 en T24, rekening houdend met basaal en piekgestimuleerd C-Peptide na gemengde maaltijdtest (Glucerna).