Cellule staminali mesenchimali in pazienti con diabete mellito di tipo 1

I campioni di tessuto adiposo saranno ottenuti attraverso procedure di liposuzione di tre volontari sani sottoposti a chirurgia estetica presso Clementino Fraga Filho (l'ospedale dell'Università Federale di Rio de Janeiro, Brasile). La sorologia dei donatori dovrà essere negativa per sifilide, morbo di Chagas, virus dell'epatite B, epatite C, HIV 1 e 2 e citomegalovirus.

Le cellule staminali/stromali derivate dal tessuto adiposo (ASCs) che saranno estratte su volontari sani saranno isolate, coltura e campioni saranno processati presso la Core Cell Technology della Pontifícia Universidade Católica do Paraná. In sintesi le procedure sono:

1. 100 ml di tessuto adiposo saranno lavati in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (Gibco Invitrogen). Verrà eseguita una digestione in un'unica fase con 1 mg/ml di collagenasi di tipo I (Invitrogen) per 30 minuti a 37°C durante l'agitazione permanente, seguita da una fase di filtrazione attraverso un filtro a rete da 100 µm (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford , MA, Stati Uniti). La sospensione cellulare sarà centrifugata a 800 g per 10 minuti e gli eritrociti saranno rimossi mediante tampone di lisi, pH 7.3.
2. Le restanti cellule saranno lavate a 400 g per 10 minuti e poi coltivate ad una densità di 1×105 cellule/cm2 in fiasche di coltura T75 e supplementato con DMEM-F12 (Gibco Invitrogen) con il 10% di siero fetale di vitello, penicillina (100 unità /ml) e streptomicina (100 μg/ml). Il terreno di coltura verrà sostituito tre giorni dopo la semina e poi due volte a settimana.
3. Le ASC saranno subcolture dopo aver raggiunto l'80% di confluenza, con una soluzione allo 0,5% di tripsina/EDTA (Invitrogen). Le cellule saranno ripiantate ad una densità di 4x103 cellule/cm2 per l'espansione11A.
4. Il controllo di qualità della sterilità della sospensione cellulare sarà valutato mediante test per rilevare batteri e funghi (Bact/Alert 3D, Biomerieux), endotossine (Endosafe™ PTS, Charles River) e Mycoplasma (KIT MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza). La vitalità cellulare sarà eseguita mediante citometria a flusso utilizzando il colorante vitale 7-AAD (7-Aminoactinomicina D - BD#559925) per determinare la percentuale di cellule vitali e la proteina annessina V (BD#51-65875X) per determinare la percentuale di cellule in apoptosi. L'analisi citogenetica sarà effettuata mediante il metodo GTG-banding.
5. Le cellule saranno caratterizzate fenotipicamente mediante citometria a flusso prima dell'applicazione clinica, utilizzando i seguenti anticorpi monoclonali: CD14 marcato con FITC (BD#555397), CD45 (BD#555482), CD19 (BD#555412), CD44 (BD#555478); CD73 marcato PE (BD#550257), CD90 (BD#555596), CD166 (BD#559263), HLA-DR marcato PerCP (BD#551375); CD34 etichettato APC (BD#555824), CD105 (BD#562408), CD29 (BD#559883) tutti acquistati da BD (Pharmingen). Almeno 100.000 gli eventi verranno acquisiti su un citometro a flusso BD FACSCalibur™ (BD Biosciences) e i dati verranno analizzati utilizzando il software FlowJo 10 (TreeStar)11A.

Dopo l'estrazione, l'isolamento, la coltura e l'elaborazione delle ASC, l'infusione nei pazienti con diabete di tipo 1 di recente insorgenza avverrà secondo quanto descritto di seguito:

1. Il giorno dell'infusione, il monostrato di ASCs sarà dissociato come sopra descritto e 1x106 cellule/kg del paziente ricevente sarà risospeso in 5 ml di soluzione fisiologica con 50% di albumina e 5% di anticoagulante citrato soluzione di destrosio. La sospensione cellulare verrà inviata all'ospedale in un dispositivo di raffreddamento con ghiaccio riciclato.
2. I pazienti che riceveranno ASC saranno ricoverati in ospedale il giorno dell'infusione e saranno dimessi 24 ore dopo l'infusione. Una singola dose di ASC verrà infusa in una vena periferica della parte superiore del braccio per 15-20 minuti. I pazienti inizieranno ad assumere colecalciferolo orale 2000 UI un giorno dopo l'infusione di ASC.

Test di sicurezza: gli eventi avversi verranno registrati durante il ricovero (T0) e ad ogni visita ambulatoriale di follow-up (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] e 24 [T24] mesi dopo l'infusione di ASC), con esami clinici e di laboratorio (emocromo, lipidi, funzionalità renale ed epatica, ormone stimolante la tiroide, tiroxina libera, anticorpi antitireoglobulina, calcio, fosforo e 25-idrossivitamina D, eseguiti con apparecchiatura biochimica automatizzata CMD 800 IX1) .

Valutazione della funzione clinica e pancreatica: i partecipanti saranno seguiti per 24 mesi. Alla prima visita, tutti i pazienti saranno intervistati e sottoposti a un esame fisico. Peso, altezza, indice di massa corporea (BMI), pressione sanguigna, frequenza cardiaca, frequenza di ipoglicemia e dose di insulina/kg di peso corporeo saranno valutati alla prima visita (T0) e dopo 1 (T1), 3 (T3), 6 (T6) 12 (T12), 18 (18) e 24 (24) mesi.

Gli aggiustamenti della dose di insulina verranno eseguiti ad ogni visita, se necessario. Tutti i pazienti riceveranno una guida nutrizionale secondo le raccomandazioni dell'American Diabetes Association.

Saranno prelevati campioni di sangue prima dell'infusione di ASC e a T1, T3, T6, T12, T18 e T24 per la misurazione dell'emoglobina glicata (HbA1c. Metodo: cromatografia liquida ad alta prestazione per affinità al boronato). La funzione β-cellulare sarà valutata attraverso la misurazione del C-Peptide (metodo Microparticle Chemiluminescent Immunoassay, Architect Abbott) dopo un pasto misto liquido (Glucerna®), considerando il tempo 0 (basale), 30, 60, 90 e 120 minuti. Verrà calcolata l'area sotto la curva.

Confronto con il precedente studio caso-controllo utilizzando solo l'integrazione di vitamina D come intervento:

I ricercatori confronteranno i nostri risultati con i pazienti precedentemente inclusi in uno studio caso-controllo che ha studiato gli effetti della vitamina D giornaliera 2000 UI senza l'infusione di cellule in soggetti con diabete di tipo 1 di recente insorgenza e età simile (> 15 anni), da una popolazione diversa (San Paolo) nella stessa regione del paese (sud-est brasiliano). Pertanto, i ricercatori stabiliranno tre diversi gruppi per il confronto: 1) pazienti che riceveranno ASC + integrazione di vitamina D; 2) pazienti che riceveranno solo integrazione di vitamina D; 3) pazienti che riceveranno il trattamento convenzionale per il diabete ma qualsiasi trattamento sperimentale aggiuntivo (ASC o Vitamina D).

Gli aggiustamenti della dose di insulina o la sospensione saranno eseguiti in base al controllo glicemico. Le variazioni di HbA1c, C-Peptide e dose di insulina/kg di peso corporeo saranno confrontate tra i gruppi. Il C-Peptide sarà analizzato mediante saggio immunofluorimetrico (AutoDelfia) a T0 e T6 e T12 e T18 e T24, considerando il C-Peptide stimolato basale e di picco dopo pasto misto (Glucerna).