Мезенхимальные стволовые клетки у больных сахарным диабетом 1 типа

Образцы жировой ткани будут получены в ходе процедур липосакции у трех здоровых добровольцев, проходящих эстетическую хирургию в больнице Клементино Фрага Филью (больница Федерального университета Рио-де-Жанейро, Бразилия). Сорология доноров должна быть отрицательной на сифилис, болезнь Шагаса, вирус гепатита В, гепатит С, ВИЧ 1 и 2 и цитомегаловирус.

Стволовые/стромальные клетки, полученные из жировой ткани (ASC), которые будут извлечены у здоровых добровольцев, будут выделены, культивированы и образцы будут обработаны в Core Cell Technology Папского католического университета в Паране. Вкратце, процедуры таковы:

1. 100 мл жировой ткани промывают стерильным фосфатно-солевым буфером (Gibco Invitrogen). Одностадийное расщепление 1 мг/мл коллагеназы типа I (Invitrogen) будет проводиться в течение 30 минут при 37°C при постоянном встряхивании, после чего следует стадия фильтрации через сетчатый фильтр 100 мкм (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford). , Массачусетс, США). Клеточную суспензию центрифугируют при 800 g в течение 10 минут, а эритроциты удаляют лизисным буфером, рН 7,3.
2. Оставшиеся клетки промывают при 400 г в течение 10 минут, а затем культивируют при плотности 1×105 клеток/см2 в культуральных колбах T75 и DMEM-F12 (Gibco Invitrogen) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, пенициллина (100 ед. /мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Культуральную среду заменяют через три дня после посева, а затем два раза в неделю.
3. ASC будут пересевать после достижения 80% слияния с 0,5% раствором трипсина/ЭДТА (Invitrogen). Клетки будут пересеяны с плотностью 4x103 клеток/см2 для расширения 11A.
4. Контроль качества стерильности суспензии клеток будет оцениваться с помощью тестов на выявление бактерий и грибков (Bact/Alert 3D, Biomerieux), эндотоксинов (Endosafe™ PTS, Charles River) и микоплазм (KIT MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza). Жизнеспособность клеток будет определяться с помощью проточной цитометрии с использованием витального красителя 7-AAD (7-аминоактиномицин D - BD № 559925) для определения процента жизнеспособных клеток и белка аннексина V (BD № 51-65875X) для определения процента клеток в апоптоз. Цитогенетический анализ будет выполнен методом GTG-бэндинга.
5. Клетки будут фенотипически характеризовать с помощью проточной цитометрии перед клиническим применением с использованием следующих моноклональных антител: FITC-меченый CD14 (BD № 555397), CD45 (BD № 555482), CD19 (BD № 555412), CD44 (BD № 555478); PE-меченый CD73 (BD#550257), CD90 (BD#555596), CD166 (BD#559263), PerCP-меченый HLA-DR (BD#551375); APC-меченые CD34 (BD № 555824), CD105 (BD № 562408), CD29 (BD № 559883), все они были приобретены у BD (Pharmingen). Не менее 100 000 События будут собираться на проточном цитометре BD FACSCalibur™ (BD Biosciences), а данные будут анализироваться с использованием программного обеспечения FlowJo 10 (TreeStar)11A.

После извлечения, выделения, культивирования и обработки ASC инфузия у пациентов с недавно развившимся диабетом 1 типа будет осуществляться в соответствии с приведенным ниже описанием:

1. В день инфузии монослой ASC диссоциируют, как описано выше, и 1×106 клеток/кг пациента-реципиента ресуспендируют в 5 мл физиологического раствора с 50% альбумином и 5% раствором антикоагулянта цитрата декстрозы. Клеточную суспензию отправят в больницу в холодильнике с переработанным льдом.
2. Пациенты, получающие ИСК, будут госпитализированы в день инфузии и выписаны через 24 часа после инфузии. Однократную дозу АСК вводят в периферическую вену плеча в течение 15-20 минут. Пациенты начинают принимать перорально холекальциферол 2000 МЕ через день после инфузии ИСК.

Тесты на безопасность: нежелательные явления будут регистрироваться во время госпитализации (T0) и при каждом последующем амбулаторном посещении (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] и 24 [T24] месяцев после инфузия ASC) с клиническими и лабораторными исследованиями (анализ крови, липиды, функция почек и печени, тиреотропный гормон, свободный тироксин, антитиреоглобулиновые антитела, кальций, фосфор и 25-гидроксивитамин D, выполненные на автоматизированном биохимическом оборудовании CMD 800 IX1) .

Клиническая оценка и оценка функции поджелудочной железы: участники будут наблюдаться в течение 24 месяцев. При первом посещении все пациенты будут опрошены и подвергнуты медицинскому осмотру. Вес, рост, индекс массы тела (ИМТ), артериальное давление, частоту сердечных сокращений, частоту гипогликемии и дозу инсулина/кг массы тела будут оценивать при первом посещении (Т0) и через 1 (Т1), 3 (Т3), 6 (Т6), 12 (Т12), 18 (18) и 24 (24) мес.

Коррекция дозы инсулина будет выполняться при каждом посещении по мере необходимости. Все пациенты получат рекомендации по питанию в соответствии с рекомендациями Американской диабетической ассоциации.

Образцы крови будут взяты перед инфузией ASC и в Т1, Т3, Т6, Т12, Т18 и Т24 для измерения гликированного гемоглобина (HbA1c. Метод: высокоэффективная жидкостная хроматография по аффинности к боронату). Функцию β-клеток будут оценивать посредством измерения С-пептида (метод хемилюминесцентного иммуноанализа микрочастиц, Architect Abbott) после приема жидкой смешанной пищи (Glucerna®), учитывая время 0 (базовое), 30, 60, 90 и 120 минут. Площадь под кривой будет рассчитана.

Сравнение с предыдущим исследованием случай-контроль, в котором в качестве вмешательства применялись только добавки с витамином D:

Исследователи сравнит наши результаты с результатами пациентов, ранее включенных в исследование случай-контроль, в котором изучалось влияние ежедневного приема 2000 МЕ витамина D без инфузии клеток у лиц с недавним началом диабета 1 типа и аналогичного возраста (> 15 лет), от другое население (Сан-Паулу) в том же регионе страны (юго-восток Бразилии). Поэтому исследователи создадут три разные группы для сравнения: 1) пациенты, которые будут получать ИСК + добавку витамина D; 2) пациенты, получающие только добавку витамина D; 3) пациенты, которые будут получать обычное лечение диабета, но любое дополнительное экспериментальное лечение (ASC или витамин D).

Коррекция дозы инсулина или его отмена будут проводиться в соответствии с гликемическим контролем. Изменения HbA1c, С-пептида и дозы инсулина/кг массы тела будут сравниваться между группами. C-пептид будет проанализирован с помощью иммунофлуорометрического анализа (AutoDelfia) в T0 и T6 и T12, T18 и T24, учитывая базовый и пиковый стимулированный C-пептид после теста смешанного приема пищи (Glucerna).