Mesenchymale Stammzellen bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 1

Fettgewebeproben werden durch Fettabsaugungsverfahren von drei gesunden Freiwilligen erhalten, die sich einer ästhetischen Operation im Clementino Fraga Filho (Krankenhaus der Bundesuniversität von Rio de Janeiro, Brasilien) unterziehen. Die Spender-Sorologie muss negativ auf Syphilis, Chagas-Krankheit, Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-C, HIV 1 und 2 und Zytomegalievirus sein.

Die aus Fettgewebe stammenden Stamm-/Stromazellen (ASCs), die bei gesunden Freiwilligen extrahiert werden, werden isoliert, kultiviert und Proben werden bei Core Cell Technology der Pontifícia Universidade Católica do Paraná verarbeitet. Kurz gesagt, die Verfahren sind:

1. 100 ml Fettgewebe werden in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Gibco Invitrogen) gewaschen. Ein einstufiger Verdau mit 1 mg/ml Kollagenase Typ I (Invitrogen) wird für 30 Minuten bei 37 °C unter permanentem Schütteln durchgeführt, gefolgt von einem Filtrationsschritt durch einen 100-µm-Filter (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford). , MA, USA). Die Zellsuspension wird 10 Minuten lang bei 800 g zentrifugiert, und Erythrozyten wurden durch Lysepuffer, pH 7,3, entfernt.
2. Die verbleibenden Zellen werden bei 400 g für 10 Minuten gewaschen und dann bei einer Dichte von 1 × 105 Zellen/cm2 in T75-Kulturflaschen und DMEM-F12 (Gibco Invitrogen) kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum, Penicillin (100 Einheiten /ml) und Streptomycin (100 μg/ml). Das Kulturmedium wird drei Tage nach der Aussaat und dann zweimal pro Woche ausgetauscht.
3. ASCs werden nach Erreichen von 80 % Konfluenz mit 0,5 % Trypsin/EDTA (Invitrogen)-Lösung subkultiviert. Die Zellen werden mit einer Dichte von 4 x 103 Zellen/cm2 für die Expansion11A neu plattiert.
4. Die Qualitätskontrolle der Zellsuspensionssterilität wird durch Tests zum Nachweis von Bakterien und Pilzen (Bact/Alert 3D, Biomerieux), Endotoxinen (Endosafe™ PTS, Charles River) und Mycoplasma (KIT MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza) bewertet. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Durchflusszytometrie unter Verwendung des Vitalfarbstoffs 7-AAD (7-Aminoactinomycin D – BD-Nr. 559925) zur Bestimmung des Prozentsatzes lebensfähiger Zellen und des Annexin-V-Proteins (BD-Nr. 51-65875X) zur Bestimmung des Prozentsatzes der darin enthaltenen Zellen durchgeführt Apoptose. Die zytogenetische Analyse wird mit der GTG-Banding-Methode durchgeführt.
5. Die Zellen werden vor der klinischen Anwendung durch Durchflusszytometrie phänotypisch charakterisiert, wobei die folgenden monoklonalen Antikörper verwendet werden: FITC-markiertes CD14 (BD#555397), CD45 (BD#555482), CD19 (BD#555412), CD44 (BD#555478); PE-markiertes CD73 (BD#550257), CD90 (BD#555596), CD166 (BD#559263), PerCP-markiertes HLA-DR (BD#551375); APC-markiertes CD34 (BD#555824), CD105 (BD#562408), CD29 (BD#559883), alle gekauft von BD (Pharmingen). Mindestens 100.000 Die Ereignisse werden auf einem BD FACSCalibur™ Durchflusszytometer (BD Biosciences) erfasst und die Daten werden mit der FlowJo 10 (TreeStar) Software11A analysiert.

Nach der Extraktion, Isolierung, Kultur und Verarbeitung der ASCs erfolgt die Infusion bei Patienten mit kürzlich aufgetretenem Typ-1-Diabetes wie unten beschrieben:

1. Am Tag der Infusion werden ASCs-Monolayer wie oben beschrieben dissoziiert und 1 x 106 Zellen/kg des Empfängerpatienten werden in 5 ml Kochsalzlösung mit 50 % Albumin und 5 % Antikoagulans-Citrat-Dextrose-Lösung resuspendiert. Die Zellsuspension wird in einer Kühlbox mit recyceltem Eis an das Krankenhaus geschickt.
2. Patienten, die ASCs erhalten, werden am Tag der Infusion ins Krankenhaus eingeliefert und 24 Stunden nach der Infusion entlassen. Eine Einzeldosis ASCs wird 15-20 Minuten lang in eine periphere Oberarmvene infundiert. Die Patienten beginnen einen Tag nach der ASC-Infusion mit der oralen Einnahme von Cholecalciferol 2000 UI.

Sicherheitstests: Unerwünschte Ereignisse werden während des Krankenhausaufenthalts (T0) und bei jedem ambulanten Folgebesuch (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] und 24 [T24] Monate danach) aufgezeichnet die ASCs-Infusion), mit klinischen und Laboruntersuchungen (Blutbild, Lipide, Nieren- und Leberfunktion, Schilddrüsen-stimulierendes Hormon, freies Tyroxin, Antithyreoglobulin-Antikörper, Kalzium, Phosphor und 25-Hydroxy-Vitamin D, durchgeführt mit dem automatisierten biochemischen Gerät CMD 800 IX1) .

Klinische und pankreatische Funktionsbewertung: Die Teilnehmer werden 24 Monate lang beobachtet. Beim ersten Besuch werden alle Patienten befragt und körperlich untersucht. Gewicht, Größe, Body-Mass-Index (BMI), Blutdruck, Herzfrequenz, Häufigkeit von Hypoglykämien und Insulindosis/kg Körpergewicht werden beim ersten Besuch (T0) und nach 1 (T1), 3 (T3), 6 (T6) 12 (T12), 18 (18) und 24 (24) Monate.

Anpassungen der Insulindosis werden bei jedem Besuch nach Bedarf vorgenommen. Alle Patienten erhalten eine Ernährungsberatung gemäß den Empfehlungen der American Diabetes Association.

Blutproben werden vor der ASC-Infusion und zu T1, T3, T6, T12, T18 und T24 für die Messung des glykierten Hämoglobins (HbA1c) entnommen. Methode: Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durch Boronataffinität). Die β-Zellfunktion wird durch C-Peptid-Messung (Mikropartikel-Chemilumineszenz-Immunoassay-Methode, Architect Abbott) nach einer flüssigen gemischten Mahlzeit (Glucerna®) unter Berücksichtigung der Zeit 0 (basal), 30, 60, 90 und 120 Minuten bewertet. Die Fläche unter der Kurve wird berechnet.

Vergleich mit vorheriger Fall-Kontroll-Studie mit ausschließlicher Vitamin-D-Supplementierung als Intervention:

Die Forscher werden unsere Ergebnisse mit Patienten vergleichen, die zuvor in eine Fall-Kontroll-Studie eingeschlossen waren, die die Wirkungen von täglich 2000 UI Vitamin D ohne die Infusion von Zellen bei Personen mit kürzlich aufgetretenem Typ-1-Diabetes und ähnlichem Alter (> 15 Jahre) untersuchte eine andere Population (São Paulo) in derselben Landesregion (Brasilien Südosten). Daher werden die Forscher drei verschiedene Gruppen zum Vergleich bilden: 1) Patienten, die ASCs + Vitamin-D-Supplementierung erhalten; 2) Patienten, die nur eine Vitamin-D-Ergänzung erhalten; 3) Patienten, die die konventionelle Behandlung für Diabetes erhalten, aber eine zusätzliche experimentelle Behandlung (ASCs oder Vitamin D).

Insulindosisanpassungen oder -entzug werden entsprechend der glykämischen Kontrolle durchgeführt. Änderungen der HbA1c-, C-Peptid- und Insulindosis/kg Körpergewicht werden zwischen den Gruppen verglichen. C-Peptid wird durch einen immunofluorometrischen Assay (AutoDelfia) bei T0 und T6 und T12 und T18 und T24 analysiert, wobei das Basal- und Peak-stimulierte C-Peptid nach dem Test mit gemischten Mahlzeiten (Glucerna) berücksichtigt wird.