Cellules souches mésenchymateuses chez les patients atteints de diabète de type 1

Des échantillons de tissu adipeux seront obtenus par des procédures de liposuccion de trois volontaires sains subissant une chirurgie esthétique à Clementino Fraga Filho (l'hôpital de l'Université fédérale de Rio de Janeiro, Brésil). La sorologie des donneurs devra être négative pour la syphilis, la maladie de Chagas, le virus de l'hépatite B, l'hépatite C, le VIH 1 et 2 et le cytomégalovirus.

Les cellules souches / stromales (ASC) dérivées du tissu adipeux qui seront extraites sur des volontaires sains seront isolées, la culture et les échantillons seront traités à Core Cell Technology de la Pontifícia Universidade Católica do Paraná. En bref, les procédures sont les suivantes :

1. 100 ml de tissu adipeux seront lavés dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (Gibco Invitrogen). Une digestion en une étape par 1 mg/ml de collagénase de type I (Invitrogen) sera effectuée pendant 30 minutes à 37°C sous agitation permanente, suivie d'une étape de filtration à travers un filtre à mailles de 100 µm (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford , MA, États-Unis). La suspension cellulaire sera centrifugée à 800 g pendant 10 minutes, et les érythrocytes seront éliminés par un tampon de lyse, pH 7,3.
2. Les cellules restantes seront lavées à 400 g pendant 10 minutes puis mises en culture à une densité de 1×105 cellules/cm2 dans des flacons de culture T75 et DMEM-F12 (Gibco Invitrogen) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal, pénicilline (100 unités /ml) et streptomycine (100 μg/ml). Le milieu de culture sera remplacé trois jours après l'ensemencement, puis deux fois par semaine.
3. Les ASC seront sous-cultivés après avoir atteint 80 % de confluence, avec une solution à 0,5 % de trypsine/EDTA (Invitrogen). Les cellules seront replaquées à une densité de 4x103 cellules/cm2 pour l'expansion11A.
4. Le contrôle qualité de la stérilité des suspensions cellulaires sera évalué par des tests de détection des bactéries et champignons (Bact/Alert 3D, Biomerieux), des endotoxines (Endosafe™ PTS, Charles River) et des Mycoplasmes (KIT MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza). La viabilité cellulaire sera réalisée par cytométrie en flux en utilisant le colorant vital 7-AAD (7-Aminoactinomycin D - BD#559925) pour déterminer le pourcentage de cellules viables et la protéine Annexine V (BD#51-65875X) pour déterminer le pourcentage de cellules dans l'apoptose. L'analyse cytogénétique sera effectuée par la méthode des bandes GTG.
5. Les cellules seront caractérisées phénotypiquement par cytométrie en flux avant l'application clinique, en utilisant les anticorps monoclonaux suivants : CD14 marqué au FITC (BD#555397), CD45 (BD#555482), CD19 (BD#555412), CD44 (BD#555478) ; CD73 marqué PE (BD#550257), CD90 (BD#555596), CD166 (BD#559263), HLA-DR marqué PerCP (BD#551375); CD34 marqué APC (BD#555824), CD105 (BD#562408), CD29 (BD#559883) tous achetés chez BD (Pharmingen). Au moins 100.000 les événements seront acquis sur un cytomètre en flux BD FACSCalibur™ (BD Biosciences) et les données seront analysées à l'aide du logiciel FlowJo 10 (TreeStar)11A.

Après l'extraction, l'isolement, la culture et le processus des ASC, la perfusion chez les patients atteints de diabète de type 1 d'apparition récente sera conforme à la description ci-dessous :

1. Le jour de la perfusion, la monocouche d'ASC sera dissociée comme décrit ci-dessus et 1 x 106 cellules/kg du patient receveur seront remises en suspension dans 5 ml de solution saline contenant 50 % d'albumine et 5 % d'anticoagulant citrate dextrose. La suspension cellulaire sera envoyée à l'hôpital dans une glacière avec de la glace recyclée.
2. Les patients qui recevront des ASC seront admis à l'hôpital le jour de la perfusion et sortiront 24 heures après la perfusion. Une dose unique d'ASC sera perfusée dans une veine périphérique de la partie supérieure du bras pendant 15 à 20 minutes. Les patients commenceront à prendre du cholécalciférol oral 2000 UI un jour après la perfusion des ASC.

Tests de sécurité : les événements indésirables seront enregistrés pendant l'hospitalisation (T0) et à chaque visite de suivi ambulatoire (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] et 24 [T24] mois après la perfusion des ASC), avec des examens cliniques et de laboratoire (numération sanguine, lipides, fonction rénale et hépatique, hormone stimulant la thyroïde, tyroxine libre, anticorps antithyroglobuline, calcium, phosphore et 25-hydroxy vitamine D, réalisés avec un équipement biochimique automatisé CMD 800 IX1) .

Évaluation de la fonction clinique et pancréatique : les participants seront suivis pendant 24 mois. Lors de la première visite, tous les patients seront interrogés et subiront un examen physique. Le poids, la taille, l'indice de masse corporelle (IMC), la pression artérielle, la fréquence cardiaque, la fréquence des hypoglycémies et la dose d'insuline/kg de poids corporel seront évalués lors de la première visite (T0) et après 1 (T1), 3 (T3), 6 (T6) 12 (T12), 18 (18) et 24 (24) mois.

Des ajustements de dose d'insuline seront effectués à chaque visite si nécessaire. Tous les patients recevront des conseils nutritionnels conformément aux recommandations de l'American Diabetes Association.

Des échantillons de sang seront prélevés avant la perfusion des ASC et à T1, T3, T6, T12, T18 et T24 pour la mesure de l'hémoglobine glyquée (HbA1c. Méthode : Chromatographie Liquide Haute Performance par affinité boronate). La fonction des cellules β sera évaluée par la mesure du C-Peptide (Microparticle Chemiluminescent Immunoassay method, Architect Abbott) après un repas liquide mélangé (Glucerna®), en considérant le temps 0 (basal), 30, 60, 90 et 120 minutes. L'aire sous la courbe sera calculée.

Comparaison avec une précédente étude cas-témoins utilisant uniquement une supplémentation en vitamine D comme intervention :

Les enquêteurs compareront nos résultats avec des patients précédemment inclus dans une étude cas-témoin qui a étudié les effets de 2000 UI de vitamine D par jour sans infusion de cellules chez des personnes atteintes de diabète de type 1 d'apparition récente et d'âge similaire (> 15 ans), de une population différente (São Paulo) dans la même région du pays (Sud-Est brésilien). Par conséquent, les enquêteurs établiront trois groupes différents à des fins de comparaison : 1) les patients qui recevront une supplémentation en ASC + vitamine D ; 2) les patients qui ne recevront qu'une supplémentation en vitamine D ; 3) les patients qui recevront le traitement conventionnel du diabète mais tout traitement expérimental supplémentaire (ASC ou vitamine D).

Les ajustements de dose d'insuline ou le retrait seront effectués en fonction du contrôle glycémique. Les modifications de l'HbA1c, du peptide C et de la dose d'insuline/kg de poids corporel seront comparées entre les groupes. Le peptide C sera analysé par dosage immunofluorométrique (AutoDelfia) à T0 et T6 et T12 et T18 et T24, en considérant le peptide C stimulé basal et maximal après test de repas mélangés (Glucerna).