Mezenchymální kmenové buňky u pacientů s diabetes mellitus 1. typu

Vzorky tukové tkáně budou získány liposukcí tří zdravých dobrovolníků podstupujících estetickou operaci v Clementino Fraga Filho (nemocnice Federální univerzity v Rio de Janeiru, Brazílie). Sorologie dárců bude muset být negativní na syfilis, Chagasovu chorobu, virus hepatitidy B, hepatitidu C, HIV 1 a 2 a cytomegalovir.

Kmenové/stromální buňky derivované z tukové tkáně (ASC), které budou extrahovány na zdravých dobrovolnících, budou izolovány, kultivace a vzorky budou zpracovány v Core Cell Technology na Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Stručně řečeno, postupy jsou:

1. 100 ml tukové tkáně se promyje sterilním fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (Gibco Invitrogen). Jednokrokové štěpení 1 mg/ml kolagenázy typu I (Invitrogen) bude prováděno po dobu 30 minut při 37 °C za trvalého protřepávání, následuje krok filtrace přes 100 µm mesh filtr (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford , MA, USA). Buněčná suspenze bude centrifugována při 800 g po dobu 10 minut a erytrocyty byly odstraněny lyzačním pufrem, pH 7,3.
2. Zbývající buňky se promyjí při 400 g po dobu 10 minut a poté se kultivují v hustotě 1 × 105 buněk/cm2 v kultivačních baňkách T75 a doplňku DMEM-F12 (Gibco Invitrogen) s 10 % fetálního telecího séra, penicilin (100 jednotek /ml) a streptomycin (100 ug/ml). Kultivační médium bude nahrazeno tři dny po naočkování a poté dvakrát týdně.
3. ASC budou subkultivovány po dosažení 80% konfluence s 0,5% roztokem trypsinu/EDTA (Invitrogen). Buňky budou znovu naneseny v hustotě 4x103 buněk/cm2 pro expanzi11A.
4. Kontrola kvality sterility buněčné suspenze bude hodnocena pomocí testů pro detekci bakterií a hub (Bact / Alert 3D, Biomerieux), endotoxinů (Endosafe™ PTS, Charles River) a mykoplazmat (KIT MycoAlert™ PLUS Detekce mykoplazmat, Lonza). Životaschopnost buněk bude provedena průtokovou cytometrií s použitím vitálního barviva 7-AAD (7-Aminoaktinomycin D - BD#559925) pro stanovení procenta životaschopných buněk a proteinu Annexin V (BD#51-65875X) pro stanovení procenta buněk v apoptóza. Cytogenetická analýza bude provedena metodou GTG-banding.
5. Buňky budou fenotypově charakterizovány průtokovou cytometrií před klinickou aplikací za použití následujících monoklonálních protilátek: FITC-značené CD14 (BD#555397), CD45 (BD#555482), CD19 (BD#555412), CD44 (BD#555478); CD73 značený PE (BD#550257), CD90 (BD#555596), CD166 (BD#559263), HLA-DR značený PerCP (BD#551375); CD34 značené APC (BD#555824), CD105 (BD#562408), CD29 (BD#559883), všechny zakoupené od BD (Pharmingen). Minimálně 100 tisíc události budou získány na průtokovém cytometru BD FACSCalibur™ (BD Biosciences) a data budou analyzována pomocí softwaru FlowJo 10 (TreeStar)11A.

Po extrakci, izolaci, kultivaci a zpracování ASC bude infuze u pacientů s nedávno vzniklým diabetem 1. typu probíhat podle popisu níže:

1. V den infuze se monovrstva ASC disociuje, jak je popsáno výše, a 1x106 buněk/kg pacienta příjemce se resuspenduje v 5 ml fyziologického roztoku s 50% albuminem a 5% antikoagulačním roztokem citrát-dextrózy. Buněčná suspenze bude odeslána do nemocnice v chladiči s recyklovaným ledem.
2. Pacienti, kteří dostanou ASC, budou přijati do nemocnice v den infuze a budou propuštěni 24 hodin po infuzi. Jedna dávka ASC bude podána infuzí do periferní žíly horní části paže po dobu 15-20 minut. Pacienti začnou užívat perorálně cholekalciferol 2000 UI jeden den po infuzi ASC.

Testy bezpečnosti: nežádoucí příhody budou zaznamenány během hospitalizace (T0) a při každé následné ambulantní návštěvě (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] a 24 [T24] měsíců po infuze ASCs), s klinickými a laboratorními vyšetřeními (krevní obraz, lipidy, funkce ledvin a jater, hormon stimulující štítnou žlázu, volný tyroxin, protilátky proti tyreoglobulinu, vápník, fosfor a 25-hydroxyvitamín D, prováděné na automatizovaném biochemickém zařízení CMD 800 IX1) .

Hodnocení klinické a pankreatické funkce: Účastníci budou sledováni po dobu 24 měsíců. Při první návštěvě budou všichni pacienti vyslechnuti a podstoupí fyzickou prohlídku. Váha, výška, index tělesné hmotnosti (BMI), krevní tlak, srdeční frekvence, frekvence hypoglykémie a dávka inzulínu/kg tělesné hmotnosti budou hodnoceny při první návštěvě (T0) a po 1 (T1), 3 (T3), 6 (T6) 12 (T12), 18 (18) a 24 (24) měsíců.

Úprava dávky inzulínu bude provedena při každé návštěvě podle potřeby. Všichni pacienti dostanou nutriční poradenství podle doporučení American Diabetes Association.

Vzorky krve budou odebrány před infuzí ASC a v T1, T3, T6, T12, T18 a T24 pro měření glykovaného hemoglobinu (HbA1c. Metoda: Vysoce účinná kapalinová chromatografie s boronátovou afinitou). Funkce β-buněk bude hodnocena měřením C-peptidu (metoda mikročásticové chemiluminiscenční imunoanalýzy, Architect Abbott) po tekutém smíšeném jídle (Glucerna®), s ohledem na čas 0 (bazální), 30, 60, 90 a 120 minut. Vypočte se plocha pod křivkou.

Srovnání s předchozí případovou kontrolní studií používající pouze suplementaci vitaminu D jako intervenci:

Vyšetřovatelé porovnají naše výsledky s pacienty dříve zařazenými do případové kontrolní studie, která zkoumala účinky denního 2000 UI vitaminu D bez infuze buněk u jedinců s nedávným nástupem diabetu 1. typu a podobného věku (> 15 let), od jiná populace (São Paulo) ve stejné oblasti země (jihovýchod Brazílie). Výzkumníci proto vytvoří tři různé skupiny pro srovnání: 1) pacienti, kteří budou dostávat ASC + suplementaci vitaminu D; 2) pacienti, kteří budou dostávat pouze suplementaci vitaminu D; 3) pacienti, kteří budou dostávat konvenční léčbu diabetu, ale jakoukoli další experimentální léčbu (ASC nebo vitamín D).

Úpravy dávky nebo vysazení inzulínu se provedou podle kontroly glykémie. Mezi skupinami budou porovnány změny v HbA1c, C-peptidu a dávce inzulínu/kg tělesné hmotnosti. C-Peptid bude analyzován imunofluorometrickým testem (AutoDelfia) v T0 a T6 a T12 a T18 a T24 s ohledem na bazální a vrcholově stimulovaný C-peptid po testu se smíšeným jídlem (Glucerna).