Mesenkymale stamceller hos patienter med type 1-diabetes mellitus

Fedtvævsprøver vil blive opnået gennem fedtsugning af tre raske frivillige, der gennemgår æstetisk kirurgi på Clementino Fraga Filho (hospitalet ved Federal University of Rio de Janeiro, Brasilien). Donors sorologi skal være negativ for syfilis, Chagas sygdom, Hepatitis B virus, Hepatitis C, HIV 1 og 2 og Cytomegalovirus.

De fedtvævs-afledte stam-/stromale celler (ASC'er), der vil blive ekstraheret på raske frivillige, vil blive isoleret, kultur og prøver vil blive behandlet ved Core Cell Technology i Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Kort fortalt er procedurerne:

1. 100 ml fedtvæv vaskes i sterilt fosfatpufret saltvand (Gibco Invitrogen). En et-trins fordøjelse med 1 mg/ml collagenase type I (Invitrogen) vil blive udført i 30 minutter ved 37°C under permanent omrystning, efterfulgt af filtreringstrin gennem et 100 µm mesh filter (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford , MA, USA). Cellesuspensionen vil blive centrifugeret ved 800 g i 10 minutter, og erytrocytter blev fjernet med lyseringsbuffer, pH 7,3.
2. De resterende celler vil blive vasket ved 400 g i 10 minutter og derefter dyrket ved en tæthed på 1×105 celler/cm2 i T75-kulturkolber og DMEM-F12 (Gibco Invitrogen) tilsat 10% af føtalt kalveserum, penicillin (100 enheder) /ml) og streptomycin (100 μg/ml). Dyrkningsmediet udskiftes tre dage efter podning og derefter to gange om ugen.
3. ASC'er vil blive subkultur efter at have nået 80% konfluens med 0,5% trypsin/EDTA (Invitrogen) opløsning. Celler vil blive genudpladet med en tæthed på 4x103 celler/cm2 til ekspansion11A.
4. Kvalitetskontrol af cellesuspensionssterilitet vil blive evalueret ved tests til påvisning af bakterier og svampe (Bact / Alert 3D, Biomerieux), endotoksiner (Endosafe ™ PTS, Charles River) og Mycoplasma (KIT MycoAlert ™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza). Cellelevedygtighed vil blive udført ved flowcytometri ved anvendelse af det vitale farvestof 7-AAD (7-Aminoactinomycin D - BD#559925) for at bestemme procentdelen af ​​levedygtige celler og Annexin V-protein (BD#51-65875X) for at bestemme procentdelen af ​​celler i apoptose. Cytogenetisk analyse vil blive udført ved GTG-banding metode.
5. Celler vil blive fænotypisk karakteriseret ved flowcytometri før den kliniske anvendelse ved anvendelse af følgende monoklonale antistoffer: FITC-mærket CD14 (BD#555397), CD45 (BD#555482), CD19 (BD#555412), CD44 (BD#555478); PE-mærket CD73 (BD#550257), CD90 (BD#555596), CD166 (BD#559263), PerCP-mærket HLA-DR (BD#551375); APC-mærket CD34 (BD#555824), CD105 (BD#562408), CD29 (BD#559883) alle købt fra BD (Pharmingen). Mindst 100.000 hændelser vil blive indsamlet på et BD FACSCalibur™ flowcytometer (BD Biosciences), og data vil blive analyseret ved hjælp af FlowJo 10 (TreeStar) software11A.

Efter ekstraktion, isolering, dyrkning og proces af ASC'er vil infusionen til patienter med nyligt opstået type 1-diabetes være som beskrevet nedenfor:

1. På infusionsdagen vil ASC's monolag blive dissocieret som beskrevet ovenfor, og 1x106 celler/kg af modtagerpatienten vil blive resuspenderet i 5 ml saltvandsopløsning med 50 % albumin og 5 % antikoagulant citrat dextroseopløsning. Cellesuspension sendes til hospitalet i en køler med genbrugsis.
2. Patienter, der vil modtage ASC'er, vil blive indlagt på hospitalet på infusionsdagen og udskrives 24 timer efter infusionen. En enkelt dosis ASC'er vil blive infunderet i en perifer overarmsvene i løbet af 15-20 minutter. Patienter vil begynde at takke oral cholecalciferol 2000 UI en dag efter ASC-infusionen.

Sikkerhedstest: bivirkninger vil blive registreret under indlæggelsen (T0) og ved hvert opfølgende ambulant besøg (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] og 24 [T24] måneder efter ASCs infusion), med kliniske undersøgelser og laboratorieundersøgelser (blodtal, lipider, nyre- og leverfunktion, skjoldbruskkirtelstimulerende hormon, frit tyroxin, antithyroglobulin-antistof, calcium, fosfor og 25-Hydroxy D-vitamin, udført med automatiseret biokemisk udstyr CMD 800 IX1) .

Klinisk og bugspytkirtelfunktionsevaluering: Deltagerne vil blive fulgt i 24 måneder. Ved det første besøg vil alle patienter blive interviewet og gennemgået en fysisk undersøgelse. Vægt, højde, kropsmasseindeks (BMI), blodtryk, hjertefrekvens, hyppighed af hypoglykæmi og insulindosis/kg kropsvægt vil blive evalueret ved det første besøg (T0) og efter 1 (T1), 3 (T3), 6 (T6) 12 (T12), 18 (18) og 24 (24) måneder.

Insulindosisjusteringer vil blive udført ved hvert besøg efter behov. Alle patienter vil modtage ernæringsvejledning i henhold til American Diabetes Associations anbefalinger.

Blodprøver vil blive udtaget før ASCs infusion og ved T1, T3, T6, T12, T18 og T24 til måling af glykeret hæmoglobin (HbA1c. Metode: højtydende væskekromatografi ved boronataffinitet). β-cellefunktionen vil blive evalueret gennem C-peptidmåling (Microparticle Chemiluminescent Immunoassay-metoden, Architect Abbott) efter et flydende blandet måltid (Glucerna®), i betragtning af tiden 0 (basal), 30, 60, 90 og 120 minutter. Arealet under kurven vil blive beregnet.

Sammenligning med tidligere case-kontrol undersøgelse med kun D-vitamintilskud som intervention:

Efterforskerne vil sammenligne vores resultater med patienter, der tidligere var inkluderet i et case-kontrolstudie, der undersøgte virkningerne af dagligt 2000 UI D-vitamin uden infusion af celler hos personer med nyligt opstået type 1-diabetes og lignende alder (> 15 år) fra en anden befolkning (São Paulo) i samme landsregion (Brasiliansk sydøst). Derfor vil efterforskerne etablere tre forskellige grupper til sammenligning: 1) patienter, der vil modtage ASC'er + D-vitamintilskud; 2) patienter, der kun vil modtage D-vitamintilskud; 3) patienter, der vil modtage den konventionelle behandling for diabetes, men enhver yderligere eksperimentel behandling (ASC'er eller D-vitamin).

Insulindosisjusteringer eller seponering vil blive udført i henhold til glykæmisk kontrol. Ændringer i HbA1c, C-peptid og insulindosis/kg kropsvægt vil blive sammenlignet mellem grupperne. C-peptid vil blive analyseret ved immunofluorometrisk assay (AutoDelfia) ved T0 og T6 og T12 og T18 og T24 under hensyntagen til basal- og peak-stimuleret C-peptid efter blandet måltid-test (Glucerna).