제1형 당뇨병 환자의 간엽줄기세포

지방 조직 샘플은 Clementino Fraga Filho(브라질 리우데자네이루 연방 대학 병원)에서 미용 수술을 받는 3명의 건강한 지원자의 지방 흡입 절차를 통해 얻을 것입니다. 공여자의 진단은 매독, 샤가스병, B형 간염 바이러스, C형 간염, HIV 1 및 2, 거대세포 바이러스에 대해 음성이어야 합니다.

건강한 지원자에게서 추출될 지방 조직 유래 줄기/기질 세포(ASC)는 분리되고, 배양 및 샘플은 Pontifícia Universidade Católica do Paraná의 Core Cell Technology에서 처리됩니다. 간략히 절차는 다음과 같습니다.

1. 지방 조직 100ml를 멸균 인산염 완충 식염수(Gibco Invitrogen)로 세척합니다. 1 mg/ml 콜라게나제 유형 I(Invitrogen)에 의한 1단계 소화는 영구 진탕 동안 37°C에서 30분 동안 수행되고, 100 µm 메쉬 필터(BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford)를 통한 여과 단계가 이어집니다. , 매사추세츠, 미국). 세포 현탁액을 800g에서 10분 동안 원심분리하고 적혈구를 용해 완충액(pH 7.3)으로 제거했습니다.
2. 나머지 세포는 400g에서 10분 동안 세척한 다음 T75 배양 플라스크 및 DMEM-F12(Gibco Invitrogen)에서 10% 태아 송아지 혈청, 페니실린(100 단위 /ml) 및 스트렙토마이신(100 μg/ml). 배양 배지는 파종 후 3일 후에 교체하고 그 다음에는 일주일에 두 번 교체합니다.
3. ASC는 0.5% 트립신/EDTA(Invitrogen) 용액으로 80% 합류에 도달한 후 계대 배양됩니다. 세포는 확장을 위해 4x103개 세포/cm2의 밀도로 재플레이팅됩니다11A.
4. 세포 현탁액 멸균의 품질 관리는 박테리아 및 진균(Bact/Alert 3D, Biomerieux), 내독소(Endosafe™ PTS, Charles River) 및 Mycoplasma(KIT MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza)를 검출하는 테스트로 평가됩니다. 세포 생존력은 살아있는 세포의 백분율을 결정하기 위해 중요한 염료 7-AAD(7-Aminoactinomycin D - BD#559925)를 사용하는 유세포 분석법에 의해 수행되고 세포의 백분율을 결정하기 위해 Annexin V 단백질(BD#51-65875X)로 수행됩니다. 아폽토시스. 세포유전학적 분석은 GTG-banding 방법으로 수행될 것이다.
5. 세포는 다음과 같은 단일 클론 항체를 사용하여 임상 적용 전에 유세포 분석에 의해 표현형으로 특성화됩니다: FITC-표지된 CD14(BD#555397), CD45(BD#555482), CD19(BD#555412), CD44(BD#555478); PE-표지된 CD73(BD#550257), CD90(BD#555596), CD166(BD#559263), PerCP-표지된 HLA-DR(BD#551375); APC 라벨링된 CD34(BD#555824), CD105(BD#562408), CD29(BD#559883)는 모두 BD(Pharmingen)에서 구입했습니다. 최소 100.000 이벤트는 BD FACSCalibur™ 유세포 분석기(BD Biosciences)에서 획득하고 데이터는 FlowJo 10(TreeStar) 소프트웨어11A를 사용하여 분석합니다.

ASC 추출, 분리, 배양 및 처리 후, 최근 발병한 제1형 당뇨병 환자에 대한 주입은 다음과 같이 설명됩니다.

1. 주입 당일에 ASC 단층은 위에서 설명한 대로 해리되고 수용 환자의 1x106개 세포/kg이 50% 알부민 및 5% 항응고 시트레이트 덱스트로스 용액을 포함하는 식염수 용액 5ml에 재현탁될 것입니다. 세포 현탁액은 재활용 얼음과 함께 냉각기에 넣어 병원으로 보내집니다.
2. ASC를 받을 환자는 주입 당일 병원에 입원하고 주입 후 24시간 후에 퇴원합니다. ASC의 단일 용량은 15-20분 동안 말초 상완 정맥에 주입됩니다. 환자는 ASC 주입 1일 후 경구용 콜레칼시페롤 2000 UI를 복용하기 시작합니다.

안전성 테스트: 부작용은 입원 기간(T0) 및 각 후속 외래 방문(3[T3], 6[T6], 12[T12], 18[T18] 및 24[T24]개월 후)에 기록됩니다. 자동 생화학 장비 CMD 800 IX1로 수행되는 임상 및 실험실 검사(혈구 수, 지질, 신장 및 간 기능, 갑상선 자극 호르몬, 유리 티록신, 항티로글로불린 항체, 칼슘, 인 및 25-하이드록시 비타민 D) 포함 .

임상 및 췌장 기능 평가: 참가자는 24개월 동안 추적됩니다. 첫 번째 방문에서 모든 환자는 면담을 하고 신체 검사를 받게 됩니다. 체중, 키, 체질량 지수(BMI), 혈압, 심박수, 저혈당 빈도 및 체중 kg당 인슐린 투여량을 첫 번째 방문(T0) 및 1(T1), 3(T3) 후, 6(T6) 12(T12), 18(18), 24(24)개월.

인슐린 투여량 조정은 필요에 따라 방문할 때마다 수행됩니다. 모든 환자는 미국 당뇨병 협회 권장 사항에 따라 영양 지도를 받습니다.

혈액 샘플은 당화혈색소(HbA1c. 방법: 보로네이트 친화성에 의한 고성능 액체 크로마토그래피). 베타 세포 기능은 시간 0(기초), 30, 60, 90 및 120분을 고려하여 액체 혼합 식사(Glucerna®) 후 C-펩티드 측정(Microparticle Chemiluminescent Immunoassay 방법, Architect Abbott)을 통해 평가됩니다. 곡선 아래 면적이 계산됩니다.

개입으로 비타민 D 보충만을 사용하는 이전 사례 대조 연구와 비교:

조사관은 최근 발병한 제1형 당뇨병 및 비슷한 연령(> 15세)을 가진 개인에서 세포 주입 없이 매일 2000 UI 비타민 D의 효과를 조사한 케이스 컨트롤 연구에 이전에 포함된 환자와 우리의 결과를 비교할 것입니다. 같은 국가 지역(브라질 남동부)의 다른 인구(상파울루). 따라서 조사관은 비교를 위해 세 가지 다른 그룹을 설정합니다. 1) ASC + 비타민 D 보충을 받을 환자; 2) 비타민 D 보충만을 받을 환자; 3) 당뇨병에 대한 기존 치료를 받지만 추가적인 실험적 치료(ASC 또는 비타민 D)를 받을 환자.

인슐린 용량 조절 또는 중단은 혈당 조절에 따라 수행됩니다. HbA1c, C-펩티드 및 인슐린 투여량/체중 kg의 ​​변화를 그룹 간에 비교할 것이다. C-펩티드는 T0 및 T6 및 T12 및 T18 및 T24에서 면역형광분석법(AutoDelfia)에 의해 분석될 것이며, 혼합식 시험(Glucerna) 후 기저 및 피크 자극된 C-펩티드를 고려한다.