Mesenkymala stamceller hos patienter med typ 1-diabetes mellitus

Fettvävnadsprover kommer att tas genom fettsugning av tre friska frivilliga som genomgår estetisk kirurgi vid Clementino Fraga Filho (sjukhuset vid Federal University of Rio de Janeiro, Brasilien). Givarnas sorologi måste vara negativ för syfilis, Chagas sjukdom, Hepatit B-virus, Hepatit C, HIV 1 och 2 och Cytomegalovirus.

De fettvävnadshärledda stam-/stromacellerna (ASC) som kommer att extraheras på friska frivilliga kommer att isoleras, odling och prover kommer att behandlas vid Core Cell Technology vid Pontifícia Universidade Católica do Paraná. I korthet är procedurerna:

1. 100 ml fettvävnad tvättas i steril fosfatbuffrad koksaltlösning (Gibco Invitrogen). En enstegsnedbrytning med 1 mg/ml kollagenas typ I (Invitrogen) kommer att utföras i 30 minuter vid 37°C under permanent skakning, följt av filtreringssteg genom ett 100 µm mesh-filter (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford , MA, USA). Cellsuspensionen kommer att centrifugeras vid 800 g under 10 minuter, och erytrocyter avlägsnades med lysbuffert, pH 7,3.
2. De återstående cellerna kommer att tvättas vid 400 g i 10 minuter och sedan odlas med en densitet av 1×105 celler/cm2 i T75-odlingskolvar och DMEM-F12 (Gibco Invitrogen) tillägg med 10 % kalvfosterserum, penicillin (100 enheter) /ml) och streptomycin (100 μg/ml). Odlingsmediet kommer att bytas ut tre dagar efter sådd och sedan två gånger i veckan.
3. ASC: er kommer att subkultur efter att ha nått 80% konfluens, med 0,5% trypsin/EDTA (Invitrogen) lösning. Celler kommer att replikeras med en densitet av 4x103 celler/cm2 för expansion11A.
4. Kvalitetskontroll av cellsuspensionens sterilitet kommer att utvärderas genom tester för att detektera bakterier och svampar (Bact / Alert 3D, Biomerieux), endotoxiner (Endosafe ™ PTS, Charles River) och Mycoplasma (KIT MycoAlert ™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza). Cellviabilitet kommer att utföras genom flödescytometri med det vitala färgämnet 7-AAD (7-Aminoactinomycin D - BD#559925) för att bestämma procentandelen livskraftiga celler och Annexin V-protein (BD#51-65875X) för att bestämma procentandelen celler i apoptos. Cytogenetisk analys kommer att utföras med GTG-bandningsmetod.
5. Celler kommer att karakteriseras fenotypiskt genom flödescytometri före den kliniska applikationen, med användning av följande monoklonala antikroppar: FITC-märkt CD14 (BD#555397), CD45 (BD#555482), CD19 (BD#555412), CD44 (BD#555478); PE-märkt CD73 (BD#550257), CD90 (BD#555596), CD166 (BD#559263), PerCP-märkt HLA-DR (BD#551375); APC-märkt CD34 (BD#555824), CD105 (BD#562408), CD29 (BD#559883) alla köpta från BD (Pharmingen). Minst 100 000 händelser kommer att samlas in på en BD FACSCalibur™ flödescytometer (BD Biosciences), och data kommer att analyseras med FlowJo 10 (TreeStar) programvara11A.

Efter extraktion, isolering, odling och process av ASC:er kommer infusionen till patienter med nyligen debuterad typ 1-diabetes att vara enligt beskrivningen nedan:

1. På infusionsdagen kommer ASC:s monolager att dissocieras enligt beskrivningen ovan och 1x106 celler/kg av mottagarpatienten kommer att återsuspenderas i 5 ml koksaltlösning med 50 % albumin och 5 % antikoagulerande citratdextroslösning. Cellsuspension skickas till sjukhuset i en kylare med återvunnen is.
2. Patienter som kommer att få ASC kommer att läggas in på sjukhuset dagen för infusionen och kommer att skrivas ut 24 timmar efter infusionen. En enstaka dos av ASC kommer att infunderas i en perifer överarmsven under 15-20 minuter. Patienterna kommer att börja tacka oral cholecalciferol 2000 UI en dag efter ASC-infusionen.

Säkerhetstester: biverkningar kommer att registreras under sjukhusvistelsen (T0) och vid varje uppföljande poliklinisk besök (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] och 24 [T24] månader efter ASCs infusion), med kliniska undersökningar och laboratorieundersökningar (blodantal, lipider, njur- och leverfunktion, sköldkörtelstimulerande hormon, fritt tyroxin, antityroglobulinantikropp, kalcium, fosfor och 25-hydroxivitamin D, utförd med automatiserad biokemisk utrustning CMD 800 IX1) .

Klinisk och pankreatisk funktionsutvärdering: Deltagarna kommer att följas i 24 månader. Vid det första besöket kommer alla patienter att intervjuas och genomgå en fysisk undersökning. Vikt, längd, body mass index (BMI), blodtryck, hjärtfrekvens, frekvens av hypoglykemi och insulindos/kg kroppsvikt kommer att utvärderas vid första besöket (T0) och efter 1 (T1), 3 (T3), 6 (T6) 12 (T12), 18 (18) och 24 (24) månader.

Insulindosjusteringar kommer att utföras vid varje besök efter behov. Alla patienter kommer att få näringsvägledning enligt American Diabetes Associations rekommendationer.

Blodprover kommer att tas före ASCs infusion och vid T1, T3, T6, T12, T18 och T24 för mätning av glykerat hemoglobin (HbA1c. Metod: Högpresterande vätskekromatografi genom boronataffinitet). β-cellsfunktion kommer att utvärderas genom C-peptidmätning (Microparticle Chemiluminescent Immunoassay method, Architect Abbott) efter en flytande blandad måltid (Glucerna®), med tanke på tiden 0 (basal), 30, 60, 90 och 120 minuter. Arean under kurvan kommer att beräknas.

Jämförelse med tidigare fall-kontrollstudie med endast D-vitamintillskott som intervention:

Utredarna kommer att jämföra våra resultat med patienter som tidigare ingick i en fall-kontrollstudie som undersökte effekterna av dagligt 2000 UI vitamin D utan infusion av celler hos individer med nyligen debuterad typ 1-diabetes och liknande ålder (> 15 år gamla), från en annan befolkning (São Paulo) i samma landsregion (Brasilianska sydost). Därför kommer utredarna att etablera tre olika grupper för jämförelse: 1) patienter som kommer att få ASC + vitamin D-tillskott; 2) patienter som endast får D-vitamintillskott; 3) patienter som kommer att få den konventionella behandlingen för diabetes men någon ytterligare experimentell behandling (ASC eller vitamin D).

Insulindosjusteringar eller utsättning kommer att utföras i enlighet med glykemisk kontroll. Förändringar i HbA1c, C-peptid och insulindos/kg kroppsvikt kommer att jämföras mellan grupperna. C-peptid kommer att analyseras med immunofluorometrisk analys (AutoDelfia) vid T0 och T6 och T12 och T18 och T24, med hänsyn till basal- och toppstimulerad C-peptid efter blandad måltidstest (Glucerna).