Mezenchymalne komórki macierzyste u pacjentów z cukrzycą typu 1

Próbki tkanki tłuszczowej zostaną pozyskane poprzez zabiegi liposukcji trzech zdrowych ochotników poddawanych zabiegom chirurgii estetycznej w Clementino Fraga Filho (szpital Uniwersytetu Federalnego w Rio de Janeiro, Brazylia). Sorologia dawców musi być ujemna w kierunku kiły, choroby Chagasa, wirusowego zapalenia wątroby typu B, wirusowego zapalenia wątroby typu C, HIV 1 i 2 oraz wirusa cytomegalii.

Komórki macierzyste/podścieliska pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC), które zostaną wyekstrahowane od zdrowych ochotników, zostaną wyizolowane, hodowla i próbki zostaną przetworzone w Core Cell Technology na Pontifícia Universidade Católica do Paraná. W skrócie procedury są następujące:

1. 100 ml tkanki tłuszczowej przemywa się sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (Gibco Invitrogen). Jednoetapowe trawienie 1 mg/ml kolagenazy typu I (Invitrogen) będzie wykonywane przez 30 minut w temperaturze 37°C podczas ciągłego wytrząsania, po czym następuje etap filtracji przez filtr o oczkach 100 µm (BD FALCON, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford , MA, Stany Zjednoczone). Zawiesinę komórek wiruje się przy 800 g przez 10 minut, a erytrocyty usuwa się buforem do lizy, pH 7,3.
2. Pozostałe komórki przemywa się przy 400 g przez 10 minut, a następnie hoduje z gęstością 1 × 105 komórek/cm2 w kolbach hodowlanych T75 i suplementem DMEM-F12 (Gibco Invitrogen) z 10% płodową surowicą cielęcą, penicyliną (100 jednostek /ml) i streptomycyny (100 μg/ml). Pożywkę hodowlaną należy wymienić trzy dni po wysianiu, a następnie dwa razy w tygodniu.
3. ASC będą hodowlą podrzędną po osiągnięciu 80% konfluencji, z 0,5% roztworem trypsyny/EDTA (Invitrogen). Komórki będą ponownie umieszczane na płytkach z gęstością 4x103 komórek/cm2 w celu namnażania11A.
4. Kontrola jakości sterylności zawiesiny komórkowej będzie oceniana za pomocą testów wykrywających bakterie i grzyby (Bact/Alert 3D, Biomerieux), endotoksyny (Endosafe™ PTS, Charles River) i Mycoplasma (KIT MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection, Lonza). Żywotność komórek zostanie przeprowadzona za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu barwnika witalnego 7-AAD (7-aminoaktynomycyny D – BD#559925) w celu określenia procentu żywotnych komórek i białka aneksyny V (BD#51-65875X) w celu określenia procentu komórek w apoptoza. Analiza cytogenetyczna zostanie przeprowadzona metodą GTG-banding.
5. Komórki zostaną scharakteryzowane fenotypowo za pomocą cytometrii przepływowej przed zastosowaniem klinicznym, przy użyciu następujących przeciwciał monoklonalnych: znakowane FITC CD14 (BD#555397), CD45 (BD#555482), CD19 (BD#555412), CD44 (BD#555478); CD73 znakowany PE (BD#550257), CD90 (BD#555596), CD166 (BD#559263), HLA-DR znakowany PerCP (BD#551375); Znakowane przez APC CD34 (BD#555824), CD105 (BD#562408), CD29 (BD#559883) wszystkie zakupione od BD (Pharmingen). Co najmniej 100.000 zdarzenia zostaną zarejestrowane na cytometrze przepływowym BD FACSCalibur™ (BD Biosciences), a dane zostaną przeanalizowane przy użyciu oprogramowania FlowJo 10 (TreeStar)11A.

Po ekstrakcji, wyizolowaniu, hodowli i obróbce ASC, infuzja u pacjentów z cukrzycą typu 1 o niedawnym początku będzie przebiegać zgodnie z opisem poniżej:

1. W dniu infuzji monowarstwa ASC dysocjuje jak opisano powyżej i 1x106 komórek/kg pacjenta biorcy zostanie ponownie zawieszona w 5 ml roztworu soli z 50% albuminą i 5% roztworem antykoagulantu cytrynianu dekstrozy. Zawiesina komórek zostanie wysłana do szpitala w lodówce z lodem z recyklingu.
2. Pacjenci, którzy otrzymają ASC będą przyjmowani do szpitala w dniu wlewu i wypisywani 24 godziny po wlewie. Pojedyncza dawka ASC będzie podawana we wlewie do żyły obwodowej ramienia przez 15-20 minut. Pacjenci zaczną przyjmować doustnie cholekalcyferol 2000 UI jeden dzień po infuzji ASC.

Testy bezpieczeństwa: zdarzenia niepożądane będą rejestrowane podczas hospitalizacji (T0) i podczas każdej kolejnej wizyty ambulatoryjnej (3 [T3], 6 [T6], 12 [T12], 18 [T18] i 24 [T24] miesięcy po wlew ASCs), z badaniami klinicznymi i laboratoryjnymi (morfologia krwi, lipidy, czynność nerek i wątroby, hormon tyreotropowy, wolna tyroksyna, przeciwciała antytyreoglobulinowe, wapń, fosfor i 25-hydroksywitamina D, wykonywane przy pomocy automatycznego aparatu biochemicznego CMD 800 IX1) .

Kliniczna ocena funkcji trzustki: Uczestnicy będą obserwowani przez 24 miesiące. Na pierwszej wizycie wszyscy pacjenci zostaną przesłuchani i poddani badaniu fizykalnemu. Masę ciała, wzrost, wskaźnik masy ciała (BMI), ciśnienie krwi, częstość akcji serca, częstość hipoglikemii oraz dawkę insuliny/kg masy ciała ocenia się na pierwszej wizycie (T0) oraz po 1 (T1), 3 (T3), 6 (T6) 12 (T12), 18 (18) i 24 (24) miesięcy.

Dostosowanie dawki insuliny będzie przeprowadzane podczas każdej wizyty, jeśli to konieczne. Wszyscy pacjenci otrzymają poradę żywieniową zgodnie z zaleceniami American Diabetes Association.

Próbki krwi zostaną pobrane przed infuzją ASC oraz w T1, T3, T6, T12, T18 i T24 do pomiaru hemoglobiny glikowanej (HbA1c. Metoda: wysokosprawna chromatografia cieczowa metodą powinowactwa do boronianów). Czynność komórek β będzie oceniana przez pomiar peptydu C (Metoda Chemiluminescencyjna Mikrocząsteczek Immunoassay, Architect Abbott) po płynnym mieszanym posiłku (Glucerna®), biorąc pod uwagę czas 0 (podstawowy), 30, 60, 90 i 120 minut. Pole pod krzywą zostanie obliczone.

Porównanie z poprzednim badaniem kliniczno-kontrolnym, w którym zastosowano jedynie suplementację witaminy D jako interwencję:

Badacze porównają nasze wyniki z pacjentami wcześniej włączonymi do badania kliniczno-kontrolnego, w którym oceniano wpływ dziennej dawki 2000 UI witaminy D bez wlewu komórek u osób z niedawną cukrzycą typu 1 i w podobnym wieku (> 15 lat), od inna populacja (São Paulo) w tym samym regionie kraju (południowo-wschodnia Brazylia). Dlatego badacze utworzą trzy różne grupy do porównania: 1) pacjenci, którzy otrzymają ASCs + suplementację witaminą D; 2) pacjenci, którzy będą otrzymywać wyłącznie suplementację witaminy D; 3) pacjenci, którzy otrzymają konwencjonalne leczenie cukrzycy, ale dodatkowe leczenie eksperymentalne (ASC lub witamina D).

Dostosowanie dawki insuliny lub odstawienie zostanie przeprowadzone zgodnie z kontrolą glikemii. Zmiany HbA1c, peptydu C i dawki insuliny/kg masy ciała będą porównywane między grupami. Peptyd C będzie analizowany za pomocą testu immunofluoremetrycznego (AutoDelfia) w T0 i T6 oraz T12 i T18 i T24, biorąc pod uwagę podstawowy i szczytowy stymulowany peptyd C po teście mieszanego posiłku (Glucerna).