母体の肥満による胎児の免疫反応と体脂肪のプログラミング (EpiFat)

目的:

最初の出生前訪問時（妊娠 14 週未満）で正常な BMI（> 18.5 および < 24.9）を有する妊婦から生まれた新生児（参照グループ）、および妊娠前肥満（BMI > 30 Kg/m2）で、低(慣例) DHA 摂取量 (200 mg/日) (MO グループ) と、高用量の DHA (800 mg/日) を補充した妊娠前肥満女性 (MO+DHA グループ):

• 母親の DHA 補給が新生児と生後 4 か月の小児の身体組成を変化させるかどうかを分析します。
• 妊娠中に母親に DHA を補給すると、妊娠中の母親、胎児、胎盤、生後 4 か月の子供の循環炎症促進性サイトカインと抗炎症性サイトカインおよび代謝マーカーのバランスが変化するかどうかを確認します。
• 炎症性メディエーターに対するマクロファージの反応が、肥満の母親の胎児単球に含まれる炎症性肥満関連遺伝子および抗炎症性肥満関連遺伝子のエピジェネティックマーカーの変化と関連しているかどうか、また母親へのDHA補給がこの表現型を回復させるかどうかを判定します。
• 母親の肥満が出生時の胎児単球のゲノム全体の DNA メチル化プロファイルの変化につながるかどうか、またこのエピジェネティック効果に対する母親の DHA 補給の影響を確認します。

方法論。 EpiFat 研究は、健康的な栄養を通じた母体の肥満管理、MIGHT 研究（PI: Dr. Garmendia NCT02574767）のネステッドコホートです。 MIGHT 研究では、妊娠 14 週前に産前ケアを開始した 1,000 人の患者を 4 つの並行研究群のいずれかに無作為に割り付けました。2 つのグループには 200 mg/日の DHA (シゾキトリウム油、100% DHA、DSM に基づく) が投与され、2 つのグループには 800 mg/日が投与されました。 DHA、各グループには、家庭ベースの食事と身体活動の介入を行ったグループと行わなかったグループがありました。

募集とフォローアップ: 分娩前病棟への入院時に、ドクター・ソテロ・デル・リオ病院の助産師は、適格基準を満たすすべての妊婦をこの研究に参加するよう招待し、インフォームド・コンセントのプロセスを実施します。

EpiFat 研究に参加した後、出産の瞬間に助産師が臍帯血サンプルと胎盤組織を収集します。 24時間から48時間の間。 出産後、患者は研究助産師の訪問を受けて新生児の人体測定を行い、女性の健康と出産プロセスに関する社会人口統計データと臨床情報を収集します。

生後4か月の乳児は、身体測定を評価するために、栄養・食品技術研究所（スペイン語の頭字語でINTA）の摂食環境と栄養関連慢性疾患予防研究センター（スペイン語の頭字語でCIAPEC）を訪問します。そして体組成。 この訪問では、乳児の血液サンプル (5 mL) と乳児の健康状態の情報が収集されます。 さらに、母親の身体測定が行われ、乳児の授乳と食事の頻度の調査が母親に適用されます。

サンプルサイズ：

体脂肪率 (主要結果) のサンプル サイズを計算するには、Catalano が記述した平均差 2.5% および 3.0 SD を考慮しました。 検出力 80% および p 値 0.05 を考慮すると、サンプル サイズの推定値は 1 グループあたり 45 人の被験者でした。 計算は、ソフトウェア統計/データ分析 STATA バージョン 14.0 (米国テキサス州) を使用して行われました。 追跡調査のための損失の20％を考慮して、サンプルサイズは1グループあたり54人の被験者に調整されました。

副次的結果である「インビトロでの新生児マクロファージのエピジェネティックな炎症反応」については、公表された証拠はない。 しかし、我々のグループによる以前の研究では、IL-1βプロモーターのメチル化の%については、標準体重と肥満の母親からなる各グループの新生児15人のサンプルサイズで、グループ間の統計的差異を見つけるのに十分であり、ILについては十分であることが示されています。新生児単球由来のマクロファージでは -10 グループあたり 10 人の被験者が必要でした。 したがって、これらの結果については、グループあたり 15 人の被験者のサンプル サイズとみなされました。

研究の新生児と母親の変数。

研究に含まれる変数は次のとおりです。

• 新生児/乳児の変数: 新生児マクロファージにおける体脂肪およびエピジェネティックな炎症反応の%。
• 妊娠中の母親の独立変数（妊娠14週目および妊娠24～28週目）：母親の年齢（歳）、BMI（kg/m2、分類）、体重（kg）、身長（m）、在胎週数（週+日） 、IL-6、IL-1β、TNFα、MCP-1、IL-10 (pg/mL)、トリグリセリド、コレステロール、LDL-コレステロール、VLDL、HDL (すべて mg/dl)、空腹時血糖 (mg/dL)インスリン (pg/mL)、HOMA-IR、アディポネクチン (μg/mL)、DHA の血漿レベル (μmol/L)。
• 出生時の母親の独立変数: 在胎体重増加 (kg、分類)、分娩の種類、分娩時間。
• 新生児の独立変数: 性別、年齢 (出生週数、生後週数)、体重 (g)、長さ (cm)、頭囲 (cm)、腹囲指数 (kg/m3)、在胎週数の体重 (分類)、 IL-6、IL-1β、TNFα、MCP-1、IL-10 (pg/mL)、血漿 DHA レベル (μmol/l)、皮膚ひだ (mm) (上腕二頭筋、上腕三頭筋、肩甲下筋、肩甲上筋、タイト)。
• その他の母体変数: 出産数、喫煙習慣、教育 (年数)、分娩の種類、胎盤重量 (g)。

エクスビボおよびインビトロ研究 臍帯血。 臍帯血は分娩後胎盤排出前にテルモ採血バッグ（40～100ml）に採取され、処理するまで（分娩後1～5時間以内）4℃で保存されます。

母体血中および胎児血中の DHA レベル: これらは、MIGHT Study でガスクロマトグラフィーによって測定されます。

単球の分離、細胞培養およびマクロファージの分化。 末梢血単核球 (PBMC) は、出生直後に Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州) 遠心分離を使用した Ficoll 密度勾配によって分離され、RPMI 1640 培地 (Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州) でインキュベートされ、次の密度で播種されます。 100 mm 培養ディッシュで 8 ～ 10 × 106 細胞/mL、5% CO2、37°C​​ で 2 時間。 単球の同一性はフローサイトメトリーによって評価されます。 単球を 7 日間培養して、マクロファージの分化を評価します。 マクロファージ分極は、M1 の場合は 100 ng/mL の LPS (SigmaAldrich、米国ミズーリ州) および 20 ng/mL の INFγ (R&D Systems、ミネアポリス、米国) に 24 時間曝露するか、あるいは 20 ng/mL の INFγ に曝露することによって誘導されます。 5% FBS を添加した RPMI 培地中の M2 用の IL-4 (R&D Systems、ミネアポリス、米国)。

細胞はプラスチック培養皿に播種され、37℃の制御された雰囲気のインキュベーター内でさまざまな実験条件で維持されます。

母体、新生児、乳児の血漿中の炎症促進性および抗炎症性サイトカイン、インスリン、レプチン、アディポネクチンの定量。

これらの炎症促進性メディエーターと抗炎症性メディエーターであるレプチンとインスリンは、多重化（Bio-Plex プラットフォーム）免疫測定アッセイ（MILLIPLEX xMAP 高感度ヒトサイトカインパネルおよびヒト代謝パネル、Millipore、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）を使用して定量されます。 臍帯血漿中の総アディポネクチンの定量は、高分子量および総アディポネクチン (ALPCO) ELISA キットを製造業者の指示に従って使用して行われます。

胎盤ホモジネートの調製。 胎盤は出産時に収集され、臍帯と膜を切り取った後に重量が測定され、出産後すぐに氷上に置かれ、解剖されます。 絨毛膜板、羊膜嚢、脱落膜を除去しました。 約50gの絨毛組織を細かく切り、氷冷した生理食塩水で洗います。 組織を氷冷バッファー D [250 mM スクロース、0.7 μM ペプスタチン A、1.6 μM アンチパイン、80 μM アプロチニン、1 mM EDTA、10 mM HEPES-Tris (pH 7.4)] に 4℃ で入れ、氷上でホモジナイズします。ポリトロンを使って。 ホモジネートは液体窒素中で急速冷凍され、分析またはさらなる処理まで -80°C で保存されます。

サイトカインの in vitro 発現のための定量的 PCR。 市販のキット(GenElute、Sigma)を製造業者の指示に従って使用して、単球からRNAを単離する。 RT は ImProm-II Reverse を使用して実行されます。

転写システム (Promega)。 PCRは、ヒトTNFα、IL-6、IL-1β、MCP-1およびIL-10のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実行されます。 GADPH、ATP5F1、RPLP2 の mRNA レベルは内部参照として使用されます。 プライマーの使用は検証されており、増幅、プライマー濃度、プライマー HK の効率、および実験条件における HK の安定性がチェックされています。 標的遺伝子の相対発現は、2-delta delta ct 法を使用して計算されます。

単球の特性評価のためのフローサイトメトリー。 さまざまな表面マーカーの発現は、フローサイトメトリーを使用して評価されます。フローサイトメトリーは、単球サブタイプの同定のために全血で、または免疫表現型の同定のためにインビトロで分化したマクロファージで行われます。 循環単球 (CD86+ 細胞) の中で、古典的および非古典的サブタイプは、CD14 および CD16 の表面発現に従って評価されます。

マクロファージの免疫表現型（すなわち、 M1 および M2）は、特定のマーカー（例: M1 および M2）の発現に従って評価されます。 CCR2、CXCL13、CX3CR、CD62L、KLF4、TNFα、NO産生）。 サンプルは研究室で染色され、48 時間以内にチリ大学のフローサイトメトリー施設 (CyAnTM ADP アナライザー (Beckman Coulter®)) に送られます。

グローバル DNA メチローム。 DNA メチローム分析は、サウサンプトンの Graham Burdge 博士および Karen Lillycrop 博士と共同で、Illumina の Infinium Mmethylation EPIC BeadChip キットを使用して行われます。

DNA メチル化分析。 TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、IL-10、PPARγ、および PCG1α をコードする遺伝子のプロモーター領域 (転写開始部位から約 400 bp) の DNA メチル化状態は、亜硫酸水素塩を使用して測定されます。 DNA 配列決定に関連した修飾。 簡単に説明すると、細胞からの全 DNA 抽出物を亜硫酸水素ナトリウムで処理して、非メチル化シトシンをウラシルに変換し、プロモーター領域を、私たちのグループが使用し公開している戦略に従って特異的なものを使用して PCR によって増幅します。 簡単に言うと、PCR プライマーの 1 つが 5'-ビオチン タグを含むように設計され、これにより PCR ミックスからアンプリコンを直接精製できるようになります。 次に、ビオチンを含む増幅された DNA 鎖は、配列決定のために PyroMark Q96 MD パイロシーケンサー (Qiagen) に転送されます。 部位特異的な CpG メチル化は、亜硫酸水素塩非感受性 CpG (保存された C、メチル化 CpG) と亜硫酸水素塩感受性 CpG (変換された C→T、非メチル化 CpG) のシグナル強度を比較してパーセンテージとして決定されます。

統計分析。 記述統計の場合、量的変数には平均 ± SD または中央値と四分位範囲が適用され、カテゴリには n を含むパーセンテージが適用されます。 分布は Shapiro Wilk テストで検証されます。 脂肪量と循環マーカーの差は、データ分布に従って ANOVA または Kruskal Wallis によって決定されます。 スピアマン (パラメトリック) 相関またはピアソン (パラメトリックなし) 相関を適用して、従属変数と独立変数 (母体変数と新生児変数) 間の関連性を決定します。 独立変数をロジスティック回帰モデルと線形回帰モデルに当てはめて、相互作用を評価し、交絡因子を特定します。 インビトロ研究の場合、2 つ以上のグループ間の比較は、それぞれスチューデントの対応のない t 検定および分散分析 (ANOVA) によって実行されます。 ANOVA が変数間に有意な相互作用を示した場合、選択したグループと多重比較ボンフェローニ補正検定を比較する際に、Dunns によって事後分析が実行されました。 サイトカインに対するインビトロ反応のデータは用量反応曲線に当てはめられ、そこから最大の反応と薬剤効力 (pD2 = -Log EC50) が得られます。 異なる条件下での曲線と最大応答の比較は、ANOVA によって分析されます。 すべての分析は、統計的有意性のカットオフとして p<0.05 を考慮して、統計ソフトウェア Graphpad Prism、STATA、または SPSS を使用して実行されます。