Føtal programmering af immunrespons og kropsfedt ved maternal fedme (EpiFat)

MÅL:

Hos nyfødte født af gravide kvinder med normalt BMI (> 18,5 og <24,9) ved det første prænatale besøg (<14 ugers graviditet) (referencegruppe) og med præ-gestational fedme (BMI >30 Kg/m2) med lav (sædvanligt) DHA-indtag (200 mg/dag) (MO-gruppe) og præ-gestationelle overvægtige kvinder suppleret med en høj dosis af DHA (800 mg/dag) (MO+DHA-gruppe) vil vi:

• Analyser, om modertilskud af DHA ændrer kropssammensætningen hos nyfødte og børn i 4 måneders alderen.
• Bestem, om modertilskud med DHA under graviditeten ændrer balancen mellem cirkulerende pro- og antiinflammatoriske cytokiner og metaboliske markører hos moderen under graviditeten, fosteret, moderkagen og barnet ved 4 måneders alderen
• Bestem, om makrofagers respons på inflammatoriske mediatorer associerer med ændrede epigenetiske markører i pro- og antiinflammatoriske fedme-relaterede gener i føtale monocytter fra overvægtige mødre, og om DHA-modertilskud vender denne fænotype tilbage.
• Bestem, om maternel fedme udmønter sig i ændringer i den genom-dækkende DNA-methyleringsprofil i føtale monocytter ved fødslen og indvirkningen af ​​maternel DHA-tilskud på denne epigenetiske effekt.

METODOLOGI. EpiFat-undersøgelsen, er en indlejret kohorte i Maternal Obesity Control ThrouGh Healthy NuTrition, MIGHT-studiet (PI: Dr. Garmendia NCT02574767). MIGHT-studiet randomiserede 1000 patienter, der begyndte deres prænatale pleje før 14 ugers svangerskab, til en af ​​fire parallelle undersøgelsesarme: 2 grupper fik 200 mg/dag DHA (baseret på Schizochytrium-olie, 100 % DHA, DSM) og 2 grupper 800 mg/dag DHA, hver gruppe havde en gruppe med og en uden hjemmebaseret kost og fysisk aktivitetsintervention.

Rekruttering og opfølgning: Ved indlæggelse på førfødselsafdelingen inviterer jordemødre på Dr. Sótero del Río Hospital alle de gravide kvinder, der opfylder berettigelseskriterierne, til at deltage i denne undersøgelse og udfører informeret samtykkeproces.

Efter rekruttering i EpiFat-studiet, ved leveringstidspunktet, indsamler jordemoder navlestrengsblodprøver og placentavæv. Mellem 24 og 48 timer. efter fødslen besøges patienter af forskningsjordemoderen for at udføre antropometri til den nyfødte og indsamle sociodemografiske data og kliniske oplysninger om kvinders helbred og fødslen.

Efter 4 måneder får spædbørn et besøg i forskningscentret i spisemiljø og forebyggelse af associerede til ernæringskroniske sygdomme (CIAPEC for hans spanske akronym) fra Institute of Nutrition and Food Technology (INTA for hans spanske akronym) for at evaluere antropometri. og kropssammensætning. I dette besøg indsamles spædbarnsblodprøver (5 ml.) og spædbarns sundhedsstatusoplysninger. Endvidere udføres maternal antropometri, og spædbørns fodring og madhyppighedsundersøgelser anvendes på moderen.

Prøvestørrelse:

For at beregne prøvestørrelsen for kropsfedtprocent (primært resultat) blev anset for en gennemsnitlig forskel på 2,5 % og 3,0 SD, som blev beskrevet af Catalano. I betragtning af en styrke på 80 % og en p-værdi på 0,05 var prøvestørrelsen estimeret 45 forsøgspersoner pr. gruppe. Beregningen blev foretaget ved hjælp af softwaren Statistics/Data Analysis STATA version 14.0 (Texas, USA). I betragtning af et tab på 20 % for at følge op blev prøvestørrelsen justeret til 54 forsøgspersoner pr. gruppe.

For det sekundære resultat "den epigenetisk drevne inflammatoriske respons af neonatale makrofager in vitro" er der ingen evidens offentliggjort. Tidligere undersøgelser fra vores gruppe har dog vist, at: For % af methylering i IL-1β-promotoren var en prøvestørrelse på 15 nyfødte pr. gruppe fra normalvægtige og overvægtige moder nok til at finde en statistisk forskel mellem grupperne og for IL -10 i makrofager afledt af neonatale monocytter 10 forsøgspersoner pr. gruppe var nødvendig. Derfor blev det for disse resultater betragtet som en stikprøvestørrelse på 15 forsøgspersoner pr. gruppe.

STUDIETS NYFØDE OG MODERNE VARIABLER.

Variablerne inkluderet i undersøgelsen er:

• Variabler for nyfødte/spædbørn: % af kropsfedt og epigenetisk drevet inflammatorisk respons i neonatale makrofager.
• Uafhængige variabler for mødrene under graviditeten (uge 14 og 24-28 af graviditeten): moderens alder (år), BMI (kg/m2, klassifikation), vægt (kg), højde (m), gestationsalder (uge + dage) IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), triglycerider, kolesterol, LDL-kolesterol, VLDL, HDL (alle i mg/dl), fastende glykæmi (mg/dl) og insulin (pg/mL), HOMA-IR, adiponectin (ug/mL), plasmaniveauer af DHA (μmol/l).
• Uafhængige variabler for moderen ved fødslen: svangerskabsforøgelse (kg, klassificering), fødselstype, arbejdstimer.
• Uafhængige variabler for den nyfødte: køn, alder (uger ved fødslen, uger efter fødslen), vægt (g), længde (cm), hovedomkreds (cm), ponderalt indeks (kg/m3), vægt for gestationsalder (klassificering), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), plasmaniveauer af DHA (μmol/l), hudfolder (mm) (biceps, triceps, subscapular, suprailiac og tight).
• Andre maternelle variabler: paritet, rygevane, uddannelse (år), fødselstype, placentavægt (g).

EX VIVO & IN VITRO STUDIER NAVLELEVELVÆR. Navlestrengsblod opsamles efter fødslen og før placentauddrivelse i Terumo-blodopsamlingsposer (40-100 ml) og opbevares ved 4°C indtil behandling (inden for 1-5 timer efter fødslen).

DHA-NIVEAUER I MODER- OG FOSTERBLOD: Disse vil blive målt i MIGHT-undersøgelse ved gaskromatografi.

MONOCYT ISOLERING, CELLEKULTUR OG MAKROFAGEDFFERENTIATION. Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) adskilles kort efter fødslen ved hjælp af Ficoll-densitetsgradient ved hjælp af Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) centrifugering og inkuberes i RPMI 1640-medium (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) og udsås ved en tæthed på 8 til 10 × 106 celler/ml i 100 mm kulturskåle ved 5 % CO2 i 2 timer ved 37°C. Monocytidentitet vurderes ved flowcytometri. Monocytter dyrkes i 7 dage for at vurdere makrofagdifferentiering. Makrofagepolarisering induceres ved at udsætte 100 ng/ml LPS (SigmaAldrich, Missouri, USA) i 24 timer og 20 ng/mL INFγ (R&D Systems, Minneapolis, USA) for M1 eller alternativt for 20 ng/ml IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, USA) for M2 i RPMI-medium suppleret med 5 % FBS.

Celler podes på plastikkulturskåle og holdes i en inkubator med kontrolleret atmosfære ved 37°C med forskellige eksperimentelle betingelser.

KVANTIFIKATION AF PRO- OG ANTI-INFLAMMATORISKE CYTOKINER, INSULIN, LEPTIN & ADIPONEKTIN I MØDER-, NEONATAL OG SPÆDNINGSPLASMA.

Disse pro- og anti-inflammatoriske mediatorer, leptin og insulin kvantificeres ved hjælp af en multiplekset (Bio-Plex platform) immunometrisk assay (MILLIPLEX xMAP High Sensitivity Human Cytokine Panel og human metabolic panel, Millipore, Billerica, MA, USA). Kvantificering af total adiponectin i navlestrengsplasma udføres med High Molecular Weight & Total Adiponectin (ALPCO) ELISA-kit i henhold til producentens instruktioner.

FREMSTILLING AF PLACENTALE HOMOGENATER. Placenta opsamles ved fødslen og vejes efter trimning af snor og membraner, lægges straks på is efter fødslen og dissekeres. Chorionpladen, fostersækken og decidua fjernet. Ca. 50 g villøst væv skæres i små stykker og skylles med iskoldt fysiologisk saltvand. Væv vil blive anbragt i iskold buffer D [250 mM saccharose, 0,7 μM pepstatin A, 1,6 μM antipain, 80 μM aprotinin, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-Tris (pH 7,4)] ved 4°C og homogeniseret ved 4°C ved hjælp af en polytron. Homogenatet lynfryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80°C indtil analyse eller videre bearbejdning.

KVANTITATIV PCR TIL IN VITRO-EKSPRESSION AF CYTOKINER. RNA isoleres fra monocytter ved hjælp af et kommercielt kit (GenElute, Sigma) i henhold til producentens instruktioner. RT udføres med ImProm-II Reverse.

Transskriptionssystem (Promega). PCR udføres under anvendelse af oligonukleotidprimere for human TNFa, IL-6, Il-1β, MCP-1 og IL-10. Niveauerne af mRNA'er for GADPH, ATP5F1 og RPLP2 bruges som interne referencer. Primere er valideret til brug: kontrol af amplifikation, primerkoncentrationer, effektivitetsprimere-HK og stabilitet af HK under eksperimentelle forhold. Relativ ekspression af målgener beregnes ved hjælp af 2-delta delta ct-metoden.

FLOW CYTOMETRI FOR MONOCYTER KARATERISERING. Ekspressionen af ​​forskellige overflademarkører evalueres ved hjælp af flowcytometri, som udføres enten i fuldblod til identifikation af monocytundertyper eller in vitro differentierede makrofager til identifikation af immunfænotypen. Blandt cirkulerende monocytter (CD86+ celler) vurderes klassiske og ikke-klassiske undertyper i henhold til deres overfladeekspression af CD14 og CD16.

Immunfænotype af makrofager (dvs. M1 og M2) vurderes i henhold til ekspressionen af ​​specifikke markører (f.eks. CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFa, NO produktion). Prøver farves i laboratoriet og sendes til en flowcytometrifacilitet ved Universidad de Chile (CyAnTM ADP-analysator (Beckman Coulter®), inden for 48 timer.

GLOBAL DNA METHYLOME. DNA Methylome analysen er udført i samarbejde med Dr. Graham Burdge og Dr. Karen Lillycrop fra Southampton ved hjælp af Infinium Methylation EPIC BeadChip kit fra Illumina.

DNA METHYLATIONSANALYSE. DNA-methyleringsstatus for promotorregionerne (ca. 400 bp fra transkriptionsstartstedet) af generne, der koder for TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARγ og PCG1α, vil blive bestemt ved hjælp af bisulfit modifikation koblet til DNA-sekventering. Kort fortalt vil samlede DNA-ekstrakter fra celler blive behandlet med natriumbisulfit for at omdanne ikke-methyleret cytosin til uracil, og promotorregioner vil blive amplificeret ved PCR ved anvendelse af specifikke i henhold til den strategi, der anvendes og offentliggjort af vores gruppe. Kort fortalt vil en af ​​PCR-primerne blive designet med et 5'-biotinmærke, som vil tillade oprensning af amplikonet direkte fra PCR-blandingen. Derefter vil biotinholdig amplificeret DNA-streng blive overført til en PyroMark Q96 MD pyrosequencer (Qiagen) til sekventering. Stedspecifikke CpG-methyleringer vil blive bestemt som procent, ved at sammenligne signalintensiteten af ​​ikke-bisulfitfølsomt CpG (konserveret C, methyleret CpG) og bisulfitfølsomt CpG (konverteret C→T, umethyleret CpG).

STATISTISK ANALYSE. For beskrivende statistik vil der blive anvendt middelværdi ± SD eller median- og interkvartilområde for kvantitative variable, og procent med n for kategorier. Distributionerne vil blive verificeret med en Shapiro Wilk-test. Forskelle i fedtmasse og cirkulerende markører vil blive bestemt af ANOVA eller Kruskal Wallis i henhold til datafordeling. Spearman (parametrisk) eller Pearson (ingen parametrisk) korrelation vil blive anvendt til at bestemme sammenhængen mellem afhængige og uafhængige (maternale og neonatale) variable. Uafhængige variabler vil blive tilpasset til logistiske og lineære regressionsmodeller for at evaluere interaktioner samt for at identificere forstyrrende faktorer. Til in vitro undersøgelser vil sammenligninger mellem to eller flere grupper blive udført ved hjælp af henholdsvis Students uparrede t-test og variansanalyse (ANOVA). Hvis ANOVA viser en signifikant interaktion mellem variabler, blev post hoc analyser udført af Dunns ved sammenligning af udvalgte grupper og multiple sammenligning Bonferroni korrektionstest. Data for in vitro-responser på cytokiner vil blive tilpasset til dosis-respons-kurver, hvorfra maksimal respons og lægemiddelstyrke (pD2 = -Log EC50) vil blive opnået. Sammenligning af kurver og maksimale responser under forskellige forhold vil blive analyseret ved ANOVA. Alle analyserne vil blive udført med den statistiske software Graphpad Prism, STATA eller SPSS, idet der tages hensyn til en p<0,05 som cut-off for statistisk signifikans.