Fetální programování imunitní odpovědi a tělesného tuku obezitou matky (EpiFat)

CÍLE:

U novorozenců narozených těhotným ženám s normálním BMI (> 18,5 a < 24,9) při první prenatální návštěvě (< 14 týdnů gestace) (referenční skupina) a s pregestační obezitou (BMI > 30 kg/m2) s nízkou (obvyklý) příjem DHA (200 mg/den) (skupina MO) a předgestační obézní ženy doplněné vysokou dávkou DHA (800 mg/den) (skupina MO+DHA):

• Analyzujte, zda suplementace DHA matkou mění složení těla u novorozenců a dětí ve věku 4 měsíců.
• Zjistěte, zda mateřská suplementace DHA během těhotenství mění rovnováhu cirkulujících prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů a metabolických markerů u matky během těhotenství, plodu, placenty a dítěte ve věku 4 měsíců
• Zjistěte, zda reakce makrofágů na zánětlivé mediátory souvisí se změněnými epigenetickými markery v pro- a protizánětlivých genech souvisejících s obezitou ve fetálních monocytech obézních matek a zda suplementace DHA ze strany matek tento fenotyp vrátí zpět.
• Zjistěte, zda se mateřská obezita promítá do změn v celogenomovém profilu metylace DNA ve fetálních monocytech při narození, a na dopad suplementace DHA matkou na tento epigenetický účinek.

METODOLOGIE. Studie EpiFat je vnořená kohorta ve studii Mateřské obezity ThrouGh Healthy NuTrition, MIGHT (PI: Dr. Garmendia NCT02574767). Studie MIGHT randomizovala 1 000 pacientek, které zahájily prenatální péči před 14. týdnem těhotenství, do jednoho ze čtyř paralelních ramen studie: 2 skupiny dostávaly 200 mg/den DHA (na základě oleje Schizochytrium, 100% DHA, DSM) a 2 skupiny 800 mg/den DHA, každá skupina měla skupinu s domácí dietou a intervencemi fyzické aktivity a jednu bez nich.

Nábor a sledování: Při přijetí na předporodní oddělení porodní asistentky nemocnice Dr. Sótero del Río pozvou všechny těhotné ženy, které splňují kritéria způsobilosti, k účasti na této studii a provedou proces informovaného souhlasu.

Po náboru do studie EpiFat porodní asistentka v okamžiku porodu odebere vzorky pupečníkové krve a tkáň placenty. Mezi 24 až 48 hodinami. po porodu pacientky navštíví výzkumná porodní asistentka, aby provedla antropometrii novorozence a shromáždila sociodemografická data a klinické informace o zdraví žen a průběhu porodu.

Ve 4 měsících mají kojenci návštěvu ve Výzkumném centru pro stravovací prostředí a prevenci chronických onemocnění spojených s výživou (CIAPEC pro jeho španělskou zkratku) z Institutu výživy a potravinářských technologií (INTA pro jeho španělskou zkratku), aby zhodnotili antropometrii. a složení těla. Při této návštěvě se odebírají vzorky krve kojenců (5 ml) a informace o zdravotním stavu kojence. Dále se provádí mateřská antropometrie a u matky se aplikuje průzkum krmení kojenců a frekvence jídla.

Velikost vzorku:

Pro výpočet velikosti vzorku pro procento tělesného tuku (primární výsledek) byl uvažován průměrný rozdíl 2,5 % a 3,0 SD, které popsal Catalano. S uvážením síly 80 % a p-hodnoty 0,05 byl odhad velikosti vzorku 45 subjektů na skupinu. Výpočet byl proveden pomocí softwaru Statistics/Data Analysis STATA verze 14.0 (Texas, USA). Vzhledem k 20% ztrátě pro sledování byla velikost vzorku upravena na 54 subjektů na skupinu.

Pro sekundární výsledek „epigeneticky řízená zánětlivá reakce novorozeneckých makrofágů in vitro“ nejsou publikovány žádné důkazy. Předchozí studie z naší skupiny však ukázaly, že: Pro % metylace v promotoru IL-1β stačila velikost vzorku 15 novorozenců na skupinu od matky s normální hmotností a obézní matky k nalezení statistického rozdílu mezi skupinami a pro IL -10 v makrofázích odvozených z neonatálních monocytů bylo zapotřebí 10 subjektů na skupinu. Proto se pro tyto výsledky uvažovalo o velikosti vzorku 15 subjektů na skupinu.

NOVOROZENÉ A MATEŘSKÉ PROMĚNNÉ STUDIUM.

Proměnné zahrnuté ve studii jsou:

• Proměnné novorozenců/kojenců: % tělesného tuku a epigeneticky podmíněná zánětlivá reakce u novorozeneckých makrofágů.
• Nezávislé proměnné matek během těhotenství (14. a 24.-28. týden těhotenství): věk matky (roky), BMI (kg/m2, klasifikace), hmotnost (kg), výška (m), gestační věk (týden + dny) , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/ml), triglyceridy, cholesterol, LDL-cholesterol, VLDL, HDL (vše v mg/dl), glykémie nalačno (mg/dl) a inzulín (pg/ml), HOMA-IR, adiponektin (ug/ml), plazmatické hladiny DHA (μmol/l).
• Nezávislé proměnné matky při porodu: gestační hmotnostní přírůstek (kg, klasifikace), typ porodu, doba porodní.
• Nezávislé proměnné novorozence: pohlaví, věk (týdny po narození, postnatální týdny), hmotnost (g), délka (cm), obvod hlavy (cm), ponderální index (kg/m3), hmotnost pro gestační věk (klasifikace), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/ml), plazmatické hladiny DHA (μmol/l), kožní řasy (mm) (biceps, triceps, subskapulární, suprailiakální a těsný).
• Další mateřské proměnné: parita, kuřácký návyk, vzdělání (roky), typ porodu, hmotnost placenty (g).

EX VIVO & IN VITRO STUDUJE PUPUČNÍ KREV. Pupečníková krev se odebírá po porodu a před vypuzením placenty do odběrových vaků Terumo (40-100 ml) a skladuje se při 4 °C až do zpracování (do 1-5 hodin po porodu).

HLADINY DHA V KRVI MATEK A FETÁLU: Budou měřeny ve studii MIGHT pomocí plynové chromatografie.

IZOLACE MONOCYTŮ, BUNĚČNÁ KULTURA A DIFERENCIACE MAKROfágů. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) jsou odděleny krátce po narození pomocí gradientu hustoty Ficoll pomocí centrifugace Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) a inkubovány v médiu RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) a naočkovány v hustotě 8 až 10 x 106 buněk/ml ve 100 mm kultivačních miskách při 5% CO2 po dobu 2 hodin při 37 °C. Identita monocytů se hodnotí průtokovou cytometrií. Monocyty se kultivují po dobu 7 dnů, aby se vyhodnotila diferenciace makrofágů. Polarizace makrofágů je indukována vystavením po dobu 24 hodin působení 100 ng/ml LPS (SigmaAldrich, Missouri, USA) a 20 ng/ml INFγ (R&D Systems, Minneapolis, USA) pro M1 nebo alternativně 20 ng/ml IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, USA) pro M2 v médiu RPMI doplněném 5% FBS.

Buňky jsou nasazeny na plastové kultivační misky a udržovány v inkubátoru s řízenou atmosférou při 37 °C s různými experimentálními podmínkami.

KVANTIFIKACE PRO- A PROTIZÁNĚTLIVÝCH CYTOKINŮ, INZULÍNU, LEPTINU & ADIPONEKTINU V MATEŘSKÉ, NEONATÁLNÍ A KOJENSKÉ PLAZMĚ.

Tyto pro a protizánětlivé mediátory, leptin a inzulín jsou kvantifikovány pomocí multiplexního (platforma Bio-Plex) imunometrického testu (MILLIPLEX xMAP High Sensitivity Human Cytokine Panel a lidský metabolický panel, Millipore, Billerica, MA, USA). Kvantifikace celkového adiponektinu v plazmě z pupečníku se provádí pomocí soupravy ELISA s vysokou molekulovou hmotností a celkovým adiponektinem (ALPCO) podle pokynů výrobce.

PŘÍPRAVA PLACENTÁLNÍCH HOMOGENÁTŮ. Placenty jsou odebrány při porodu a zváženy po oříznutí provazce a membrán, ihned po dodání umístěny na led a rozřezány. Odstraněna choriová ploténka, plodový vak a decidua. Přibližně 50 g vilózní tkáně se nařeže na malé kousky a promyje se ledově studeným fyziologickým roztokem. Tkáň bude umístěna do ledově chladného pufru D [250 mM sacharóza, 0,7 μM pepstatin A, 1,6 μM proti bolesti, 80 μM aprotinin, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-Tris (pH 7,4)] a homogenizována na ledu o 4 °C pomocí polytronu. Homogenát se rychle zmrazí v kapalném dusíku a skladuje se při -80 °C až do analýzy nebo dalšího zpracování.

KVANTITATIVNÍ PCR PRO IN VITRO EXPRESI CYTOKINŮ. RNA se izoluje z monocytů pomocí komerční soupravy (GenElute, Sigma) podle pokynů výrobce. RT se provádí pomocí ImProm-II Reverse.

Transkripční systém (Promega). PCR se provádí za použití oligonukleotidových primerů pro lidský TNFa, IL-6, IL-lp, MCP-1 a IL-10. Hladiny mRNA pro GADPH, ATP5F1 a RPLP2 se používají jako interní reference. Primery jsou validovány pro použití: kontrola amplifikace, koncentrace primerů, účinnost primerů-HK a stabilita HK v experimentálních podmínkách. Relativní exprese cílových genů se vypočítá pomocí metody 2-delta delta ct.

PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE PRO CHARATERIZACI MONOCYTŮ. Exprese různých povrchových markerů je hodnocena pomocí průtokové cytometrie, která se provádí buď v plné krvi pro identifikaci subtypů monocytů nebo in vitro diferencovaných makrofágů pro identifikaci imunofenotypu. Mezi cirkulujícími monocyty (CD86+ buňky) jsou klasické a neklasické podtypy hodnoceny podle jejich povrchové exprese CD14 a CD16.

Imunofenotyp makrofágů (tj. M1 a M2) se hodnotí podle exprese specifických markerů (např. CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFα, produkce NO). Vzorky jsou obarveny v laboratoři a odeslány do zařízení průtokové cytometrie na Universidad de Chile (analyzátor CyAnTM ADP (Beckman Coulter®) do 48 hodin.

GLOBÁLNÍ METHYLOM DNA. Analýza DNA Methylome se provádí ve spolupráci s Dr. Grahamem Burdge a Dr. Karen Lillycrop ze Southamptonu pomocí sady Infinium Methylation EPIC BeadChip od Illumina.

METHYLAČNÍ ANALÝZA DNA. Stav methylace DNA oblastí promotoru (přibližně 400 bp od místa startu transkripce) genů kódujících TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARγ a PCG1α bude určen pomocí bisulfitu modifikace spojená se sekvenováním DNA. Stručně řečeno, celkové extrakty DNA z buněk budou ošetřeny hydrogensiřičitanem sodným, aby se převedl nemethylovaný cytosin na uracil, a promotorové oblasti budou amplifikovány pomocí PCR za použití specifické podle strategie použité a publikované naší skupinou. Stručně řečeno, jeden z PCR primerů bude navržen včetně 5'-biotinového tagu, který umožní purifikaci amplikonu přímo z PCR směsi. Poté bude amplifikované vlákno DNA obsahující biotin přeneseno do pyrosekvenátoru PyroMark Q96 MD (Qiagen) pro sekvenování. Místně specifické methylace CpG budou stanoveny jako procento, porovnáním intenzity signálu nebisulfitově citlivého CpG (konzervovaný C, methylovaný CpG) a bisulfitově citlivého CpG (přeměněný C→T, nemethylovaný CpG).

STATISTICKÁ ANALÝZA. Pro deskriptivní statistiku se použije průměr ± SD nebo medián a interkvartilní rozmezí pro kvantitativní proměnné a procento s n pro kategorie. Distribuce budou ověřeny testem Shapiro Wilk. Rozdíly v tukové hmotě a cirkulujících markerech určí ANOVA nebo Kruskal Wallis podle distribuce dat. Ke stanovení asociace mezi závislými a nezávislými (mateřskými a novorozeneckými) proměnnými bude použita Spearmanova (parametrická) nebo Pearsonova (neparametrická) korelace. Nezávislé proměnné budou přizpůsobeny logistickým a lineárním regresním modelům k vyhodnocení interakcí a také k identifikaci matoucích faktorů. Pro studie in vitro budou srovnání mezi dvěma nebo více skupinami provedena pomocí Studentova nepárového t-testu a analýzy rozptylu (ANOVA). Pokud ANOVA prokazuje významnou interakci mezi proměnnými, provedl Dunns post hoc analýzy při srovnávání vybraných skupin a vícenásobném srovnání Bonferroniho korekčního testu. Data pro in vitro odezvy na cytokiny se proloží do křivek dávka-odpověď, ze kterých se získá maximální odezva a účinnost léčiva (pD2 = -Log EC50). Porovnání křivek a maximálních odezev za různých podmínek bude analyzováno pomocí ANOVA. Všechny analýzy budou provedeny se statistickým softwarem Graphpad Prism, STATA nebo SPSS s uvažováním p<0,05 jako hranice pro statistickou významnost.