母体肥胖对胎儿免疫反应和体脂的编程 (EpiFat)

宗旨：

第一次产前检查（<14 周妊娠）（参考组）BMI 正常（> 18.5 和 <24.9）且妊娠前肥胖（BMI >30 Kg/m2）低（习惯）DHA 摄入量（200 毫克/天）（MO 组）和补充高剂量 DHA（800 毫克/天）的孕前肥胖女性（MO+DHA 组）我们将：

• 分析母亲补充 DHA 是否会改变新生儿和 4 个月大儿童的身体成分。
• 确定母亲在怀孕期间补充 DHA 是否会改变母亲怀孕期间、胎儿、胎盘和 4 个月大的孩子体内循环促炎和抗炎细胞因子和代谢标志物的平衡
• 确定巨噬细胞对炎症介质的反应是否与肥胖母亲胎儿单核细胞中促炎和抗炎肥胖相关基因的表观遗传标记改变有关，以及母体补充 DHA 是否能恢复这种表型。
• 确定母体肥胖是否转化为出生时胎儿单核细胞全基因组 DNA 甲基化谱的变化，以及母体 DHA 补充剂对这种表观遗传效应的影响。

方法。 EpiFat 研究是通过健康营养控制孕产妇肥胖的嵌套队列，MIGHT 研究（PI：Garmendia 博士 NCT02574767）。 MIGHT 研究将 1000 名在妊娠 14 周前开始产前护理的患者随机分配到四个平行研究组之一：2 组接受 200 毫克/天 DHA（基于裂殖壶菌油、100% DHA、DSM）和 2 组 800 毫克/天DHA，每组有一组有和没有家庭饮食和身体活动干预。

招募与跟进：Dr. Sótero del Río 医院的助产士在进入预产室时邀请所有符合资格标准的孕妇参与本研究，并进行知情同意程序。

在 EpiFat 研究中招募后，在分娩时，助产士会收集脐带血样本和胎盘组织。 24 到 48 小时之间。 分娩后，研究助产士会拜访患者，对新生儿进行人体测量，并收集有关妇女健康和分娩过程的社会人口统计数据和临床信息。

在 4 个月大时，婴儿前往营养与食品技术研究所（INTA，西班牙文首字母缩写词）的饮食环境和预防营养慢性疾病研究中心（CIAPEC，西班牙文首字母缩写词），评估人体测量学和身体成分。 在这次访问中，收集了婴儿血液样本（5 毫升）和婴儿健康状况信息。 此外，还进行了母体人体测量，并对母亲进行了婴儿喂养和食物频率调查。

样本量：

计算体脂百分比（主要结果）的样本量被认为是 Catalano 描述的 2.5% 和 3.0 SD 的平均差异。 考虑到 80% 的功效和 0.05 的 p 值，样本量估计为每组 45 名受试者。 使用软件 Statistics/Data Analysis STATA version 14.0 (Texas, USA) 进行计算。 考虑到 20% 的失访率，将样本量调整为每组 54 名受试者。

对于次要结果“体外新生儿巨噬细胞的表观遗传驱动的炎症反应”，没有发表证据。 然而，我们小组之前的研究表明：对于 IL-1β 启动子中的甲基化百分比，每组来自正常体重和肥胖母亲的 15 个新生儿的样本量足以发现组间的统计差异，并且对于 IL -10 来自新生儿单核细胞的巨噬细胞 每组需要 10 名受试者。 因此，对于这些结果，它被认为是每组 15 名受试者的样本量。

研究的新生儿和母体变量。

研究中包含的变量是：

• 新生儿/婴儿的变量：新生儿巨噬细胞中体脂百分比和表观遗传驱动的炎症反应。
• 准妈妈孕期（孕14周和24-28周）自变量：产妇年龄（岁）、BMI（kg/m2，分类）、体重（kg）、身高（m）、胎龄（周+天） 、IL-6、IL-1β、TNFα、MCP-1、IL-10 (pg/mL)、甘油三酯、胆固醇、LDL-胆固醇、VLDL、HDL（均以 mg/dl 为单位）、空腹血糖 (mg/dL)和胰岛素 (pg/mL)、HOMA-IR、脂联素 (ug/mL)、血浆 DHA 水平 (μmol/l)。
• 母亲出生时的自变量：妊娠期体重增加（公斤，分类）、分娩方式、分娩时间。
• 新生儿自变量：性别、年龄（出生周数、产后周数）、体重（g）、身长（cm）、头围（cm）、体重指数（kg/m3）、胎龄体重（分类）、 IL-6、IL-1β、TNFα、MCP-1、IL-10 (pg/mL)、DHA 血浆水平 (μmol/l)、皮褶 (mm)（二头肌、三头肌、肩胛下肌、髂上肌和紧绷肌）。
• 其他母体变量：胎次、吸烟习惯、教育（年）、分娩类型、胎盘重量（g）。

体外和体外研究脐带血。 脐带血在分娩后和胎盘排出前收集在 Terumo 采血袋（40-100 毫升）中，并在 4°C 下储存直至处理（分娩后 1-5 小时内）。

母血和胎儿血液中的 DHA 水平：这些将在 MIGHT 研究中通过气相色谱法测量。

单核细胞分离、细胞培养和巨噬细胞分化。 外周血单核细胞 (PBMC) 在出生后不久通过 Ficoll 密度梯度分离，使用 Histopaque-1077（Sigma-Aldrich，美国密苏里州）离心，并在 RPMI 1640 培养基（Sigma-Aldrich，美国密苏里州）中孵育，并以8 至 10 × 106 个细胞/mL，在 100 mm 培养皿中，5% CO2，37°C 培养 2 小时。 单核细胞身份通过流式细胞术评估。 单核细胞培养 7 天以评估巨噬细胞分化。 通过将 M1 暴露于 100 ng/mL LPS（SigmaAldrich，美国密苏里州）和 20 ng/mL INFγ（R&D Systems，Minneapolis，US）24 小时或暴露于 20 ng/mL IL-4（R&D Systems，明尼阿波利斯，美国）用于 RPMI 培养基中的 M2，辅以 5% FBS。

将细胞接种在塑料培养皿上，并在 37°C 的受控气氛培养箱中以不同的实验条件进行培养。

母体、新生儿和婴儿血浆中促炎和抗炎细胞因子、胰岛素、瘦素和脂联素的定量分析。

这些促炎和抗炎介质、瘦素和胰岛素使用多重（Bio-Plex 平台）免疫测定法（MILLIPLEX xMAP 高灵敏度人类细胞因子面板和人类代谢面板，Millipore，Billerica，MA，USA）进行量化。 根据制造商的说明，使用高分子量和总脂联素 (ALPCO) ELISA 试剂盒对脐带血浆中的总脂联素进行定量。

胎盘匀浆的制备。 胎盘在分娩时收集并在脐带和胎膜修剪后称重，分娩后立即置于冰上并解剖。 去除绒毛膜板、羊膜囊和蜕膜。 将约 50 g 的绒毛组织切成小块，用冰冷的生理盐水冲洗。 将组织置于 4°C 的冰冷缓冲液 D [250 mM 蔗糖、0.7 μM 胃酶抑素 A、1.6 μM 抗疼痛、80 μM 抑肽酶、1 mM EDTA、10 mM HEPES-Tris (pH 7.4)] 中并在冰上匀浆使用 polytron。 匀浆液在液氮中快速冷冻并储存在 -80°C 直至分析或进一步处理。

细胞因子体外表达的定量 PCR。 根据制造商的说明，使用商业试剂盒（GenElute，Sigma）从单核细胞中分离出 RNA。 RT 与 ImProm-II Reverse 一起使用。

转录系统（Promega）。 使用针对人 TNFα、IL-6、IL-1β、MCP-1 和 IL-10 的寡核苷酸引物进行 PCR。 GADPH、ATP5F1 和 RPLP2 的 mRNA 水平用作内部参考。 引物的使用经过验证：检查扩增、引物浓度、效率引物-HK 和 HK 在实验条件下的稳定性。 使用 2-delta delta ct 方法计算目标基因的相对表达。

用于单核细胞表征的流式细胞术。 使用流式细胞术评估不同表面标记的表达，流式细胞术在全血中进行以鉴定单核细胞亚型或在体外分化的巨噬细胞中进行以鉴定免疫表型。 在循环单核细胞（CD86+ 细胞）中，根据 CD14 和 CD16 的表面表达评估经典和非经典亚型。

巨噬细胞的免疫表型（即 M1 和 M2）根据特定标记物（例如 CCR2、CXCL13、CX3CR、CD62L、KLF4、TNFα、NO 生产）。 样品在实验室染色并在 48 小时内送到智利大学的流式细胞仪（CyAnTM ADP 分析仪（Beckman Coulter®））。

全球 DNA 甲基化酶。 DNA 甲基化组分析是与来自南安普顿的 Graham Burdge 博士和 Karen Lillycrop 博士合作完成的，使用的是 Illumina 的 Infinium 甲基化 EPIC BeadChip 试剂盒。

DNA 甲基化分析。 使用亚硫酸氢盐测定编码 TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、IL-10、PPARγ 和 PCG1α 的基因的启动子区域（距转录起始位点约 400 bp）的 DNA 甲基化状态修饰耦合到 DNA 测序。 简而言之，细胞的总 DNA 提取物将用亚硫酸氢钠处理，将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，启动子区域将根据我们小组使用和发表的策略使用特异性 PCR 进行扩增。 简而言之，其中一个 PCR 引物将被设计为包括 5'-生物素标签，这将允许直接从 PCR 混合物中纯化扩增子。 然后将含有生物素的扩增 DNA 链转移到 PyroMark Q96 MD 焦磷酸测序仪（Qiagen）进行测序。 位点特异性 CpG 甲基化将确定为百分比，比较非亚硫酸氢盐敏感 CpG（保守的 C，甲基化 CpG）和亚硫酸氢盐敏感 CpG（转化的 C→T，未甲基化 CpG）的信号强度。

统计分析。 对于描述性统计，将对定量变量应用均值±标准差或中位数和四分位距，对类别应用百分比和 n。 分布将通过 Shapiro Wilk 测试进行验证。 脂肪量和循环标志物的差异将根据数据分布通过 ANOVA 或 Kruskal Wallis 确定。 将应用 Spearman（参数）或 Pearson（无参数）相关性来确定因变量和自变量（母体和新生儿）变量之间的关联。 自变量将适用于逻辑和线性回归模型，以评估相互作用以及识别混杂因素。 对于体外研究，两组或更多组之间的比较将分别通过学生未配对 t 检验和方差分析 (ANOVA) 进行。 如果方差分析表明变量之间存在显着的相互作用，则 Dunns 在比较选定组和多重比较 Bonferroni 校正检验时进行事后分析。 对细胞因子的体外反应的数据将被拟合到剂量反应曲线，从中将获得最大反应和药物效力 (pD2 = -Log EC50)。 将通过方差分析分析不同条件下的曲线和最大响应的比较。 所有分析都将使用统计软件 Graphpad Prism、STATA 或 SPSS 进行，将 p<0.05 视为统计显着性的截止值。